长穗偃麦草EeSKOR启动子的克隆及功能分析

张 勇，田小霞，郑明利，毛培春，孟 林

(北京市农林科学院草业花卉与景观生态研究所，北京 100097)

钾(K+)在植物生长发育中起关键作用。植物通过根系从土壤中吸收所需的K+，然后将其分配到不同的器官，以满足正常的生长发育[1-6]。植物体内K+的远距离分布和动态平衡主要由位于质膜上的各种K+通道介导。根据这些通道蛋白的序列、结构和功能可分为4类，即Shaker、TPK、Kir-like和GNGC钾通道[2, 5-7]，其中，Shaker 型K+通道的研究最为透彻。Shaker型K+通道对底物K+的亲和常数约为几十毫摩尔，是典型的低亲和高通量K+通道，对植物K+营养效率起重要作用[2-4, 6]。根据电压依赖性和K+在跨膜过程中运动方向的不同，Shaker型K+通道可分为3种类型，即包括内向整流通道、外向整流通道和弱整通道(双向整流通道)。SKOR是典型的外向整流K+通道[7-8]，该通道负责K+通过根部木质部的长距离运输。在拟南芥(Arabidopsisthaliana)中，SKOR通道生理功能的分子机制研究更为详细，即AtSKOR主要位于根的中柱轴薄壁细胞中，负责将K+释放到木质部汁液中，从而通过植物蒸腾作用转移至地上部分，实现K+离子远距离运输；同时发现AtSKOR通道功能的缺失会使地上部K+含量降低50%左右，影响植物生长发育。近年来，SKOR在水稻(Oryzasativa)[8]、甜瓜(Cucumismelo)[9]、小花碱茅(Puccinelliatenuiflora)[10]和霸王(Zygophyllumxanthoxylum)[11]中得到了广泛的研究，进一步证实了SKOR基因在维持植物体内K+稳态方面发挥关键作用，特别是植物在缺钾、干旱和盐胁迫条件下均能诱导SKOR基因表达。

启动子位于基因的转录起始位点附近，为不同的转录因子提供不同的结合位点，这进一步促成RNA聚合酶进行基因转录[12-13]。不同的启动子元件用于结合激活物或阻遏物，从而充当顺式调节元件[14]。启动子作为控制基因转录的开关，已成为研究基因功能的新方向。通过分析启动子顺式作用元件，可预测该基因可能具备的功能。

长穗偃麦草(Elytrigiaelongata)具有很强的抗旱耐盐性，是小麦的近缘种，已成为改良小麦重要的野生基因库[15]，同时也是改良盐碱土壤的理想草本植物之一。先前的研究中我们通过cDNA末端快速扩增(RACE)方法获得了长穗偃麦草SKOR基因，盐胁迫能诱导EeSKOR转录，表明EeSKOR在维持植物K+的稳态、改善植物的耐盐性方面起着重要作用[16]。然而SKOR基因是否在长穗偃麦草生长发育中发挥其他的功能尚未知晓。本研究利用热不对称交错PCR(Tail-PCR)的方法克隆了长穗偃麦草EeSKOR启动子序列，分析该启动子干旱诱导(PEG)、脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)等响应元件，分析不同胁迫处理下长穗偃麦草EeSKOR的表达模式，为进一步系统研究EeSKOR功能提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 材 料

实验所用拟南芥野生型Columbia-0(Col-0)购自ABRC (ArabidopsisBiological Resource Center) 生物公司，长穗偃麦草(PI 531747)种子由美国国家植物种质资源库(The U. S. National Plant Germplasm System, NPGS)提供，并参照周妍彤等[17]描述的组织培养方法获得长穗偃麦草组培苗，生根后的组培苗置于光照16 h/8 h(白天/黑夜)、26 ℃的人工气候室培养。

1.2 方 法

1.2.1EeSKOR启动子的克隆以长穗偃麦草基因组DNA为模板，根据已获得的EeSKOR基因cDNA序列，设计下游特异性套嵌引物EeSKORsp1、EeSKORsp2、EeSKORsp3(表1)；使用染色体步移试剂盒(TaKaRa)，按孙君[18]所用的程序进行巢式PCR。第3轮PCR获得单一条带，PCR产物胶回收后连入PMD20-T载体，继而转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经菌液PCR鉴定，选择阳性菌液送至北京博睿兴科生物公司测序。

1.2.2EeSKOR启动子顺式作用元件分析及表达载体构建测序结果经拼接、比对，获得正确的EeSKOR启动子序列，利用启动子在线分析软件PlantCARE和PLACE对启动子顺式作用元件进行对比分析。并根据已知的启动子序列设计酶切引物(表1)进行PCR，分别使用Hind Ⅲ和XbaⅠ酶消化植物表达载体pBI121-GUS和PCR产物，经纯化回收后构建EeSKOR启动子驱动GUS基因表达的植物表达载体，重组植物表达载体pEeSKOR∷GUS继而转化农杆菌GV3301。

表1 本研究所用的引物序列及用途

1.2.3 农杆菌瞬时转化拟南芥及GUS染色将含有pEeSKOR∷GUS的农杆菌接种至添加有相应抗生素的LB培养基中，于28 ℃震荡培养至OD600值0.8，参照郭勇等[19]拟南芥瞬时转化的方法转化拟南芥。

GUS染色液的制备：200 mmol/L的磷酸缓冲液50 mL(pH 7.0)，5 mmol/L的K3[Fe(CN)6]溶液10 mL，5 mmol/L的K4[Fe(CN)6] 溶液10 mL，100 mmol/L的Na2EDTA溶液10 mL，0.1 mL Triton-100，加入60 mg X-GLUC用蒸馏水定容至100 mL。将浸染后的拟南芥转移至GUS染色液，37 ℃避光培养24 h。待培养完毕，弃染色液，用95%酒精脱色，观察染色结果并拍照。

1.2.4 实时定量PCR检测长穗偃麦草EeSKOR基因表达分别用10%聚乙二醇(PEG)、100 mmol/L氯化钠(NaCl)、0.1 mmol/L脱落酸(ABA)和0.5 mmol/L水杨酸(SA)处理长穗偃麦草组培苗，分别取不同处理时间(0、12、24和72 h)长穗偃麦草的根，提取RNA，反转录成cDNA，以长穗偃麦草Actin为内参基因，使用qEeSKOR定量引物按照王琳等[20]描述的qPCR反应程序检测EeSKOR基因的表达量，每个样品3次技术重复，3次生物学重复。

2 结果与分析

2.1 EeSKOR启动子克隆

通过3轮热不对称PCR分析，获得约1 000 bp单一条带(图1，A)。该电泳条带经胶回收，连入克隆载体。菌液PCR结果表明，该条带已成功连接至T载体(图1，B)。测序结果与EeSKOR基因cDNA序列比对，我们获得了EeSKOR基因起始密码子上游798 bp启动子序列，命名为pEeSKOR。经NCBI网站比对分析显示，pEeSKOR序列与中国春小麦(Triticumaestivum)、预测的节节麦(Aegilopstauschii)和预测的野生二粒麦(Triticumdicoccoides)基因存在部分高度相似序列。

2.2 启动子作用元件分析

将pEeSKOR上传至PLACE和PlantCARE网站对启动子元件进行分析(图2和表2)。该启动子含有特异转录因子结合位点(MYB、MYC和BoxⅢ等)、植物激素响应元件(ABRE和TGA-element)、光响应元件(GAG-motif、CATT-motif和LAMP-element等)、组织特异的启动元件(CAT-box、RY-element和CCGTCC-box)、胁迫响应顺式元件(MBS、ARE和W box等)和核心启动元件(TATA box和CAAT box)。

A. EeSKOR 启动子扩增：1—3分别代表1—3轮PCR产物；B. EeSKOR 启动子克隆载体PCR鉴定：1—6代表不同的样品；—代表阴性对照图1 EeSKOR启动子克隆 A. Amplified EeSKOR promoter：1-3 represents 1-3 rounds of PCR products respectively；B. PCR identification of EeKSOR promoter cloning vector：1-6 represent different samples；— represents negative controlFig.1 Cloning of EeSKOR promoter

转录起始位点G标记为“+1”, 上游位置为负；黑体代表起始密码子图2 EeSKOR启动子序列及调控元件The nucleotide at position “+1” is the transcription start site, the upstream of which are negative position; Bold represents the start codonFig.2 Sequence and regulatory elements of EeSKOR promoter

2.3 启动子表达载体构建及转化

采用双酶切的方法，将pEeSKOR构建到pBI121-GUS植物表达载体(图3，A)，转化农杆菌GV3101，菌落PCR及双酶切验证结果表明pEeSKOR已成功整合到植物表达载体中(图3，B-C)，构建好的pEeSKOR植物表达载体命名为pEeSKOR∷GUS。

通过农杆菌介导的瞬时转化方法，pEeSKOR驱动GUS基因在拟南芥中的表达如图4所示，在拟南芥幼苗期的叶、叶柄和根中呈蓝色(图4，A)，同样在拟南芥生殖生长期的叶、叶柄和根观测到GUS活性(图4，B-E)，但并未在花中观测到GUS活性(图4，F)。

2.4 不同胁迫处理下长穗偃麦草根中EeSKOR表达分析

启动子元件显示pEeSKOR含有干旱诱导、ABA和SA响应元件，利用实时定量PCR检测PEG、NaCl、ABA和SA处理下EeSKOR在长穗偃麦草组培苗根中的表达量。如图5所示， NaCl处理下EeSKOR的表达量在12 h处下调为正常表达水平的54%，之后恢复至正常表达水平且呈上调趋势；PEG处理下EeSKOR基因的表达量呈上调趋势，处理的12 h并未与正常表达水平产生差异，处理24 h和72 h分别上调为正常表达水平的2.1倍和5.9倍；ABA处理下EeSKOR的表达量低于正常表达水平，且随着处理时间增加显著下调；SA处理导致EeSKOR表现出先上调后下调趋势，其在12 h上调至正常表达水平的2倍，在24 h较正常水平稍有上调(1.4倍)，而在72 h显著下调至正常表达水平的44%。

3 讨 论

长穗偃麦草是小麦族禾本科偃麦草属多年生根茎疏丛型草本植物，具有较强的抗旱耐盐性，是改良盐碱地的理想草本植物之一，因此深入了解其耐盐生理机制尤为重要。外整流钾通道蛋白基因SKOR在增强植物耐盐性方面发挥着重要作用，充分揭示SKOR基因的功能，将有针对性地通过基因工程方法对物种进行遗传改良；而启动子是调控基因的时空表达开关，分析启动子顺式作用元件，可以推测基因潜在的功能。本研究通过Tail-PCR技术获得长穗偃麦草EeSKOR起始密码子前798 bp启动子片段，启动子元件分析结果显示，该启动子含有多种顺式作用元件。如组织特异的启动元件RY-element和CAT-box、干旱诱导元件MBS、脱落酸响应元件ABRE、水杨酸响应元件TCA-element等；而启动子区的ABA响应元件和SA响应元件与基因参与的逆境胁迫和相应激素的信号转导相关联[21-24]，表明EeSKOR基因的表达可能受到干旱、脱落酸和水杨酸的诱导。此外，EeSKOR启动子还含光响应元件、厌氧反应元件、伤害与病原反应元件，表明EeSKOR可能在长穗偃麦草光响应和防御机制中起作用。

表2 EeSKOR启动子中的顺式作用元件及相关功能预测

A. 表达载体示意图；B. 表达载体菌落PCR；C. 表达载体酶切鉴定图3 EeSKOR启动子表达载体构建及酶切验证A. Schematic diagram of expression vector; B. Expression vector colony PCR; C. Expression vector restriction digestion identificationFig.3 Construction of EeSKOR promoter expression vector and restriction enzyme digestion verification

A. 幼苗期植株；B. 生殖生长期植株；C.叶片；D.叶柄；E.根；F.花序图4 pEeSKOR∷GUS拟南芥的组织化学GUS测定A. Juvenile plants; B. Reproductive growth plants; C. Leaves; D. Petioles; E. Root; F. InflorescenceFig.4 Histochemical GUS determination of pEeSKOR∷GUS Arabidopsis thaliana

*和**分别表示处理后与未处理(0 h)间在0.05和0.01水平的差异显著性图5 不同胁迫处理下长穗偃麦草根中EeSKOR表达分析* and ** indicate the significance of the difference between the treated and untreated (0 h) at the levels of 0.05 and 0.01, respectivelyFig.5 Expression analysis of EeSKOR in the roots of Elytrigia elongata under different stress treatments

为了鉴定获得的启动子是否具备启动转录活性，同时验证EeSKOR启动子在长穗偃麦草不同组织的表达模式。我们构建了长穗偃麦草EeSKOR启动子驱动GUS报告基因的植物表达载体，通过农杆菌介导瞬时浸染拟南芥组织，结果显示在幼苗和生殖生长时期，拟南芥的根、叶和叶柄均被染成蓝色，且幼苗生长期的拟南芥染色程度较生殖生长期更深，表明EeSKOR可能在长穗偃麦草根、叶和叶鞘的生长发育中发挥重要作用，尤其是幼苗期。

SKOR是负责植物中K+长距离运输的一类重要的通道蛋白，在维持植物细胞K+的稳态和抗逆性中发挥着至关重要的作用[25]。SKOR的转录水平极易受到各种胁迫的影响，300 mmol/L NaCl条件下，甜菜(Betavulgaris)和甜瓜根中的SKOR表达量在12、24和72 h显著增加[9, 26]， NaCl或渗透胁迫下霸王ZxSKOR在其根和茎中的转录水平为正常生长条件下的2.0～2.8倍[11]。基于启动子元件分析的结果，我们检测了NaCl、PEG、ABA和SA诱导下，长穗偃麦草根中EeSKOR的表达模式。结果显示，NaCl处理下，EeSKOR的表达量在12 h处显著下调后继而恢复至正常表达水平且呈现上调趋势，这与已报道的结果[9, 11, 25]略有差异，表明盐处理下SKOR基因在不同物种中表达模式存在差异；PEG处理下，长穗偃麦草EeSKOR基因的表达量呈上调趋势，且随着时间的延长显著上调，表明EeSKOR基因在表达模式上与其他物种SKOR具备相似的功能。高玉龙等[27]认为烟草NtSKOR1受植物激素的调控，在拟南芥[7]和灰楸树(Catalpafargesii)[28]中SKOR的表达受到ABA的强烈抑制，我们在长穗偃麦草EeSKOR启动子元件中发现了响应ABA的顺式作用元件，在ABA处理下EeSKOR的表达量低于正常表达水平，且随着处理时间增加显著下调，证实了外源ABA可抑制EeSKOR表达。目前对SKOR基因的研究主要集中在干旱和盐胁迫方面鲜有报道SKOR与水杨酸之间的关系，本研究中发现EeSKOR启动子含有水杨酸响应元件，表明EeSKOR可能受到水杨酸的诱导，而水杨酸处理12 h和24 h后EeSKOR在长穗偃麦草根中的表达量显著高于正常表达水平，而处理72 h的表达量显著低于正常表达水平，呈先上调后下调的趋势，证实了EeSKOR在长穗偃麦草响应水杨酸的过程中发挥作用。这一发现是对SKOR功能特性的重要补充，可作为探讨EeSKOR基因功能的重点方向加以深入研究。