辣木愈伤组织诱导与分化阶段内源激素的动态变化

杜建武，阮明菊，王 韦，王 睿，黄苏南，张 慧，曾千春

（云南农业大学 a.农学与生物技术学院；b.云南辣木研究所，云南 昆明 650201）

辣木Moringa oleifera为辣木科Moringaeae辣木属Moringa多年生乔木。辣木幼嫩果荚与嫩梢营养丰富，可作为蔬菜[1-2]；辣木花、叶等是传统中药材[3]；辣木籽油是化妆品和保健品的重要助剂；因其速生、生物量大，辣木还有望用作生物燃料[4]。

植物组织培养再生植株过程中，激素、外植体生理状态、培养基和培养条件等均影响愈伤组织的形成与分化，其中，内源激素的种类、含量及其比值的影响尤为重要。Prado等[5]采用液相层析-酶联免疫吸附法测定葡萄花药愈伤组织中内源激素ABA、ABA-葡糖基酯和IAA的含量，结果表明在葡萄胚性愈伤组织形成体细胞胚的过程中ABA和ABA-葡糖基酯为决定因素，IAA的作用不大。范建新等[6]采用高效液相色谱-质谱联用法研究火龙果内源激素含量变化规律，结果表明花药愈伤分化阶段，ω(GA3)/ω(ZT)处于较低水平可促进不定芽的分化。张亚芳等[7]采用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA）测定鸡血藤愈伤组织诱导和分化阶段4种内源激素含量的变化，其中IAA含量在愈伤诱导（0.715 μg/g）和分化阶段（1.87 μg/g）均较高。

当前，基因工程技术在研究基因功能、定向改变遗传性状、改良品质、培育优良新品种等方面具有广泛应用[8]。建立稳定、高效的再生体系是应用辣木遗传转化技术的前提。高燕等[9]和陈涵斌[10]使用辣木带腋芽茎段作为外植体建立组培快繁体系；向素琼等[11]以辣木无芽茎段和叶片为外植体进行培养，成功诱导愈伤组织，但未分化出完整植株；黄苏南等[12]以多油辣木PKM1的花药为外植体，诱导获得愈伤组织，并分化出根，但未获得完整植株。相对于腋芽茎段，以叶片和无芽茎段为外植体，更容易取材；通过花药培养产生加倍单倍体植株，可较快地获得纯合植株，育种选择效率高。但是，有关辣木组织培养阶段内源激素含量变化与愈伤组织形成、器官分化关系的研究鲜见报道。本研究中采用ELISA法在辣木叶片、茎段和花药等外植体愈伤组织诱导和分化阶段，分析生长素（indole-3-acetic acid，IAA）、脱落酸（abscisic acid，ABA）、玉米素（zeatin，ZT）和赤霉素（gibberellic acid，GA3）等内源激素含量的动态变化，以期为辣木组培再生体系的建立提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

叶片与茎段取自多油辣木品种PKM1的实生无菌苗（将种籽在1/2MS培养基上培养14～21 d），花药取自云南农业大学东校区温室种植的多油辣木品种PKM1未开放的花蕾（花药处于单核靠边期）。

叶片、茎段和花药的愈伤诱导培养基为1/2MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂8 g/L，pH 5.8，其中茎段的愈伤诱导培养基另添加果糖20 g/L。愈伤组织分化培养基为MS+6-BA 1.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂8 g/L，pH 5.8。

1.2 方 法

1.2.1 愈伤组织的诱导和分化

用手术刀将无菌苗叶片切割成约5 mm×5 mm，正面朝上接种于培养皿中，每21 d继代1次；无菌茎段长度约为5 mm，水平方向放置并轻轻压入培养基中，每14 d继代1次。叶片和茎段均为每个培养皿放置14块，10皿为1组，重复3次。叶片、茎段愈伤组织诱导和分化（含花药愈伤）阶段，培养条件均为温度(25±3) ℃，相对湿度70%～80%，光照强度约为800 lx，光周期（14 h光/10 h暗）。参照黄苏南等[12]的方法，剥取花药诱导愈伤组织。为保证有足够的样品，连续8周进行花药接种，每周接种24瓶，每瓶培养14个花药。

将3种外植体经过28 d诱导的愈伤组织转入分化培养基中进行分化培养。每瓶5块愈伤组织，21 d继代1次。

1.2.2 愈伤组织的内源激素含量测定

外植体接种当天为愈伤组织诱导阶段第0天，每7 d取样1次，28 d内共取样4次，叶片、茎段愈伤组织每次取样0.25 g，花药愈伤组织每次取样0.04 g，第0天的样品为叶片、茎段和花药的预留材料。外植体经28 d诱导的愈伤组织转入分化培养基当天为愈伤组织分化阶段第0天，每7 d取样1次，连续取样4次，每次取样0.25 g，第0天的样品为愈伤组织诱导第28天的样品。每处理3次生物学重复，取样后用液氮速冻放入-80 ℃冰箱中保存，2019年2—6月完成样品采集。

样品用液氮研磨后，分别装于5 mL塑料管，外加干冰保持低温，送至中国农业大学作物化学控制室，使用ELISA法测定内源激素含量。

1.3 数据处理

使用Excel 2007软件进行数据统计、绘图等处理。

2 结果与分析

2.1 辣木愈伤组织诱导与分化阶段内源激素含量的动态变化

2.1.1 诱导阶段内源激素含量的动态变化

辣木叶片、茎段和花药愈伤诱导阶段4种内源激素含量的动态变化如图1所示。

由图1可见，叶片外植体培养14 d时最早观察到细胞团。培养0 d时，叶片IAA、ABA、ZT和GA3含量依次为90.87、70.30、12.46和7.83 ng/g。叶片愈伤组织诱导过程中，IAA、ABA和ZT含量一直下降，培养28 d时分别减少了53.10、15.77和5.27 ng/g；GA3含量在培养0～14 d时下降，后略有波动。

由图1可见，茎段外植体培养7 d时最早观察到细胞团。培养0 d时，茎段IAA、ABA、ZT和GA3含量依次为70.59、56.70、11.60和9.15 ng/g。茎段愈伤组织诱导过程中，IAA含量呈现先降、后升、再降的变化趋势，在培养7 d时骤降至34.49 ng/g，培养21 d时上升至46.19 ng/g，培养28 d时下降至45.84 ng/g；ABA含量为56.70～73.85 ng/g，呈现先升、后降、再升的变化趋势；ZT、GA3含量均呈现先降、后升的变化趋势，在培养7 d时下降明显，之后略升高。

由图1可见，花药外植体培养21 d时最早观察到细胞团。经4 ℃低温处理3 d的花药中，培养0 d时，IAA、ABA、ZT和GA3含量依次为49.00、61.46、9.51和6.53 ng/g。花药愈伤组织诱导过程中，IAA含量呈现先降、后升、再降的变化趋势，在培养28 d时为20.34 ng/g，较起始IAA含量下降了58.49%；ABA含量为51.97～65.10 ng/g；ZT含量呈现下降趋势，培养21 d时降为5.6 ng/g，培养21～28 d时平稳，处于低水平状态；在花药愈伤组织诱导阶段，GA3含量无明显变化，始终处于低水平状态。

图1 辣木愈伤组织诱导阶段内源激素含量的动态变化Fig.1 Dynamic changes of endogenous hormone content in M.oleifera callus during callus induction

2.1.2 分化阶段内源激素含量的动态变化

辣木叶片、茎段和花药愈伤组织分化阶段4种内源激素含量的动态变化如图2所示。

由图2可见，叶片愈伤组织经分化培养后，IAA、ZT和GA3含量呈现先升、后降的变化趋势。其中，IAA含量在培养21 d内呈上升趋势，在培养21 d时达到峰值（57.97 ng/g），然后快速下降；ZT含量在培养7 d时达到峰值，培养7～21 d时较平稳，培养21 d后下降；GA3含量在培养21 d时达到峰值，然后下降；ABA含量呈现先升、后降、再升的变化趋势，ABA含量在培养7 d内急剧上升，接近叶片起始ABA含量，培养7 d后下降，培养14 d时降至61.49 ng/g，然后上升，培养21 d时上升至65.20 ng/g，培养21～28 d时较平稳。

由图2可见，在茎段愈伤组织分化阶段，IAA含量呈现稳定上升的趋势；ABA含量呈现先降、后升、再降的变化趋势，培养14 d内含量急剧下降，说明消耗了大量的ABA，含量为55.96～73.85 ng/g；ZT、GA3含量均呈现先升、后降的变化趋势。

由图2可见，在辣木花药愈伤组织分化阶段，IAA含量变化与叶片愈伤组织分化阶段IAA含量的变化趋势一致，均在培养21 d时达到峰值；ABA含量表现为先降、后升，培养14 d时含量最低（50.62 ng/g）；ZT含量呈现先降、后升、再降的变化趋势，含量为5.18～7.72 ng/g，整体处于低水平状态；GA3含量变化与叶片、茎段愈伤分化阶段其含量的变化趋势一致，均呈现先升、后降的变化趋势，在培养21～28 d时下降明显。

图2 辣木愈伤组织分化阶段内源激素含量的动态变化Fig.2 Dynamic changes of endogenous hormone content in M.oleifera callus at differentiation stage

2.2 辣木愈伤组织诱导与分化阶段内源激素含量比值的动态变化

2.2.1 诱导阶段内源激素含量比值的动态变化

供试辣木叶片、茎段和花药愈伤组织诱导阶段4种内源激素含量比值的动态变化如图3所示。由图3可见，诱导与分化阶段，ω(IAA)/ω(ABA)、ω(GA3)/ω(ABA)、ω(GA3)/ω(ZT)和ω(ZT)/ω(ABA)的值变化相似且多在1以下，ω(GA3)/ω(ZT)和ω(ZT)/ω(ABA)的值接近零且线条重叠。

由图3可见，在叶片愈伤组织诱导阶段，ω(IAA)/ω(GA3)、ω(IAA)/ω(ZT)均呈先下降、后升高、再下降的变化趋势，但ω(IAA)/ω(GA3)变化更明显；ω(GA3)/ω(ZT)、ω(IAA)/ω(ABA)、ω(ZT)/ω(ABA)与ω(GA3)/ω(ABA)无明显变化。

由图3可见，在茎段愈伤组织诱导阶段，ω(IAA)/ω(GA3)和ω(IAA)/ω(ZT)的变化与叶片愈伤组织中的相似，均呈先下降、后升高、再下降的变化趋势，但波峰推迟7 d到达；ω(IAA)/ω(ABA)在0～7 d下降明显；ω(GA3)/ω(ZT)、ω(ZT)/ω(ABA)和ω(GA3)/ω(ABA)的值未观察到明显变化。

由图3可见，在花药愈伤组织诱导阶段，ω(IAA)/ω(GA3)和ω(IAA)/ω(ZT)的变化趋势与叶片和茎段愈伤组织诱导阶段一致，但花药内源激素含量比值变幅更大；ω(GA3)/ω(ZT)、ω(IAA)/ω(ABA)、ω(ZT)/ω(ABA)和ω(GA3)/ω(ABA)的 值均保持在一个相对稳定的水平。

图3 辣木愈伤组织诱导阶段内源激素含量比值的动态变化Fig.3 Dynamic changes of endogenous hormone content ratio in M.oleifera callus induction stage

2.2.2 分化阶段内源激素含量比值的动态变化

供试辣木叶片、茎段和花药愈伤组织分化阶段4种内源激素含量比值的动态变化如图4所示。由图4可见，愈伤组织分化阶段，ω(IAA)/ω(ABA)、ω(GA3)/ω(ABA)、ω(GA3)/ω(ZT)和ω(ZT)/ω(ABA)的变化趋势相似且多在1以下，ω(GA3)/ω(ZT)和ω(ZT)/ω(ABA)的值接近零且线条重叠，与愈伤组织诱导阶段情况基本相同。

由图4可见，在叶片愈伤组织分化阶段，ω(IAA)/ω(GA3)的值虽呈现波动变化，但值始终较大；ω(IAA)/ω(ZT)的值呈现先升、后降的变化趋势，变化幅度较小；ω(GA3)/ω(ZT)、ω(IAA)/ω(ABA)、ω(ZT)/ω(ABA)和ω(GA3)/ω(ABA)的值无明显变化。

由图4可见，在茎段愈伤组织分化阶段，ω(IAA)/ω(GA3)和ω(IAA)/ω(ZT)的值均表现为先降、后升的趋势；ω(GA3)/ω(ZT)、ω(IAA)/ω(ABA)、ω(ZT)/ω(ABA)和ω(GA3)/ω(ABA)的值无明显变化。

由图4可见，在花药愈伤组织分化阶段，ω(IAA)/ω(ZT)、ω(IAA)/ω(GA3)的值呈波动上升趋势，ω(IAA)/ω(ZT)的值波动明显，ω(IAA)/ω(GA3)的值从4.14上升到6.83，波动相对较小；ω(GA3)/ω(ZT)、ω(IAA)/ω(ABA)、ω(ZT)/ω(ABA)和ω(GA3)/ω(ABA)的值均保持在一个相对稳定的水平。

图4 辣木愈伤组织分化阶段内源激素含量比值的动态变化Fig.4 Dynamic changes of endogenous hormone content ratio in M.oleifera callus at differentiation stage

3 结论与讨论

不同种类植物内源激素含量的差异较大，内源激素含量的比值可更好地反映植物愈伤组织诱导和分化的潜能。建立辣木离体再生体系的瓶颈在于芽的分化非常困难。从辣木愈伤组织诱导阶段的内源激素含量来看，低含量ZT有利于辣木愈伤组织的形成，高含量GA3抑制辣木愈伤组织的形成；从辣木愈伤分化阶段的内源激素含量来看，高含量ABA、低含量ZT、高ω(IAA)/ω(GA3)值、高ω(IAA)/ω(ZT)值共同抑制了辣木愈伤组织分化芽和完整植株。

3.1 内源激素含量与辣木愈伤诱导和分化的关系

植物内源激素是长期存在于植物体内的小分子化合物，含量低，但对调节植物生命活动起到决定性作用[13]。辣木愈伤组织诱导和分化阶段，ABA含量波动较大，与欧阳乐军等[14]的研究结果一致，说明内源ABA在辣木愈伤诱导和分化中发挥着重要作用。

在辣木愈伤组织诱导培养阶段，与叶片、茎段相比，花药中IAA含量最低，花药形成愈伤组织需时最长，推测高含量的IAA促进愈伤组织的形成，这与大豆[15]和苦瓜[16]的离体培养结果一致。在培养7～28 d时，叶片、茎段和花药愈伤诱导阶段IAA含量变化趋势各异，与秦小舒等[17]、田春英等[18]和董雯[19]的研究结果一致。在辣木愈伤组织的培养过程中，叶片和茎段IAA的含量始终高于花药，这也可能是辣木花药诱导愈伤率始终比叶片和茎段低的原因。在培养7～28 d时，4种内源激素中ABA含量始终处于最高水平，与董雯[19]和贾小霞等[20]分别得出的短葶山麦冬和玉米中ABA含量在愈伤诱导阶段处于低水平的研究结果相反，推测过高ABA含量对辣木愈伤组织诱导不利。辣木叶片、茎段和花药愈伤诱导阶段，ZT、GA3含量均处于较低水平，这与刘清等[21]、杨宏伟等[22]分别得出的水稻和黑果枸杞中ZT含量处于较低水平的研究结果一致，与韩继红等[23]、乔孝禄等[24]分别得出的无患子和纳塔栎中GA3含量处于较低水平的研究结果一致，说明低含量ZT有利于辣木愈伤组织的形成，高含量GA3抑制辣木愈伤组织的形成。

在辣木愈伤组织分化培养阶段，愈伤组织的量明显增多，但28 d内未分化出芽。本试验中辣木茎段IAA含量在28 d内逐渐增加，与周思宇等[25]的研究结果一致，后者在研究枇杷叶片愈伤组织分化时发现IAA含量在30 d内逐渐增加。辣木叶片和花药IAA含量呈现先升、后降的变化趋势，叶片ABA含量波动上升，花药ABA含量先降、后升，与叶片和花药不同，辣木茎段IAA含量呈现缓慢上升趋势，ABA含量呈现波动下降趋势，一定程度上说明取材部位的不同，可能导致激素水平的差异，这与范建新等[6]的研究结果一致。张亚芳等[7]和陈凌艳等[26]分别对鸡血藤和西洋杜鹃愈伤组织培养过程中内源激素的变化进行了研究，结果表明，在愈伤组织分化过程中，芽体诱导阶段所需要IAA的含量较低，在芽体生长阶段，IAA起到了一定的促进作用，IAA含量呈现先降、后升的变化趋势，此结果与本研究结果相反，推测这可能是辣木难以分化芽的一个原因。分化阶段，在4种内源激素中，3种辣木外植体愈伤组织的ABA含量始终处于最高水平，ZT含量处于低水平。张媛媛[27]经研究得出草地早熟禾愈伤组织分化阶段高含量的ABA（0.141 μg/g）对愈伤组织分化有一定的促进作用；但张亚芳等[7]在鸡血藤叶片愈伤分化的研究中发现ABA处于低水平，ZT处于高水平，有利于芽的分化。推测辣木愈伤组织中过高含量的ABA、低含量的ZT抑制了其愈伤组织的分化。除花药愈伤组织中GA3含量在分化培养21～28 d时明显下降外，叶片、茎段及花药愈伤组织分化培养0～21 d时GA3含量的变化均不明显。范建新等[6]的研究结果表明，高含量的GA3对芽分化有负面影响；陈凌艳等[26]的研究结果表明，随着芽体的形成，GA3含量逐渐提高，促进了芽体的生长和伸长。辣木GA3含量与愈伤组织分化的关系尚需深入研究。王瑞等[28]和饶丹丹[29]分别在研究油茶和紫薇组培苗生根时发现，高浓度的内源IAA及低浓度的内源ABA有利于不定根根原基的诱导分化和生长发育，高浓度的内源GA3抑制了不定根的形成，此结果与本研究中花药愈伤分化阶段结果相反，推测这可能是辣木花药诱导分化出根但未分化芽[12]的原因，各内源激素及其比例关系共同调节着辣木愈伤组织的生成。

3.2 内源激素含量比值与辣木愈伤诱导和分化的关系

在辣木叶片、茎段和花药的愈伤诱导和分化阶段，ω(IAA)/ω(GA3)的值均最高，其次为ω(IAA)/ω(ZT)，ω(ZT)/ω(ABA)和ω(GA3)/ω(ABA)的值较小且稳定，ω(IAA)/ω(ABA)、ω(GA3)/ω(ZT)和ω(ZT)/ω(ABA)的值均保持在一个相对稳定的水平。贾小霞等[20]经研究发现，在愈伤诱导阶段ω(IAA)/ω(ABA)和ω(GA3)/ω(ABA)的值大幅度上升阻碍胚性愈伤的形成，本研究中未观察到2种比值的明显变化。周思宇等[25]和张守杰等[30]报道ω(IAA)/ω(ZT)的降低能诱导愈伤组织的分化，这与本研究结果相反，推测辣木愈伤组织中ω(IAA)/ω(ZT)的值过高，抑制了其愈伤组织的分化。范建新等[6]报道ω(GA3)/ω(ZT)处于较低水平可促进不定芽的分化，张媛媛[27]经研究发现低ω(IAA)/ω(ABA)促进不定芽的形成，均与本研究结果一致。张亚芳等[7]和郭敏敏等[31]经研究发现，愈伤组织分化过程中，ω(IAA)/ω(ABA)、ω(GA3)/ω(ABA)和ω(ZT)/ω(ABA)均呈现先降、后升的变化趋势，促进不定芽的分化，在本研究中ω(IAA)/ω(ABA)、ω(GA3)/ω(ABA)和ω(ZT)/ω(ABA)在 整个愈伤组织分化阶段表现相对稳定。陈凌艳等[26]经研究发现，在愈伤组织分化过程中，IAA含量处在较低水平，GA3含量逐渐提高，促进了芽体的生长和伸长，推测较高的ω(IAA)/ω(GA3)值抑制了辣木愈伤组织的分化。由此看来，内源激素是否平衡决定着愈伤组织的状态和品质，从而直接影响到愈伤组织的分化[32]。李代丽[33]在进行白刺愈伤组织培养时发现，外源激素与内源激素存在较强的相互作用，添加不同的单一外源激素后，其内源激素总体含量水平提高，还引起激素含量间比值发生变化。黄科等[34]在进行蓝莓离体培养时发现，添加细胞分裂素ZT能促进蓝莓愈伤组织的诱导与增殖，因此在辣木愈伤组织诱导和分化过程中可考虑添加ZT。此外，辣木愈伤组织中ω(IAA)/ω(GA3)、ω(IAA)/ω(ZT)的值较高，在后续研究中可考虑先诱导生根，再生芽。

通过使用外源激素可控制愈伤组织的诱导和分化，外源激素是通过改变内源激素含量水平起调控作用的[35]。本研究中仅初步探索了辣木叶片、茎段和花药等外植体在愈伤诱导和分化阶段4种内源激素的含量及其比值的动态变化，未研究4种内源激素与外源激素的相互作用对辣木愈伤组织分化的影响，后续研究可系统探讨辣木愈伤组织培养中内外源激素的相互作用关系，筛选辣木愈伤组织培养的适宜激素配比，建立高效、稳定的辣木离体再生体系。