不同红河橙居群果实表型的变异

高玉红，魏 萌，2，李凯迪，牟凤娟

（1.西南林业大学 西南山地森林资源保育与利用教育部重点实验室，云南 昆明 650224；2.东北林业大学 林学院，黑龙江 哈尔滨 150040）

红河橙Citrus hongheensis，为芸香科Rutaceae柑橘属Citrus高大乔木，又称红河大翼橙，为大翼橙的一个种类，是较为原始的柑橘类型。该物种主要分布于云南红河流域较为狭窄的区域，生于海拔800～2 000 m的山坡杂木林中，当地哈尼族人称其“阿蕾”[1-5]。红河橙的发现为“中国是世界柑橘类植物起源中心之一”这一观点提供了佐证[6]。红河橙的翼叶较为发达，比本叶长1～3倍；株高约8 m，花白色，5～9朵排列成总状花序，稀单花腋生，花丝分离，柱头较大，花柱长6.5 mm；果淡黄色或黄绿色，大多椭圆形，果皮厚1.5～2.0 cm，油胞较大，果肉白色至淡黄色，味甚酸，微苦；种子长12 mm，宽10～12 mm，厚6～8 mm，种皮较平滑[1,7]。

广义的遗传多样性指地球上所有生物的遗传信息的总和，反映了物种基因的丰富程度，是研究物种多样性和生态系统多样性的基础[8-9]。作为生态系统中的生产者，植物遗传多样性水平对于生态系统功能的调节有着举足轻重的作用[10]。大量研究结果表明，随着植物遗传多样性水平升高，营养级动物的多样性也相应增加，从而间接地改变了群落结构甚至是生态系统的结构[11-13]，其中植物种群遗传变异和维持变异的机制可通过遗传多样性来体现[14]。研究植物遗传多样性的方法主要有形态标记、染色体标记、等位酶标记和DNA分子标记等[15]。虽然染色体标记、等位酶标记和DNA分子标记能更准确地在某些方面反映出物种的遗传多样性，但形态标记仍具有无法替代的地位[16]。经典植物分类学中，花、果、种子性状是最受重视的植物形态学性状，果实的果皮和种子是植物繁殖系统的重要特征[17]，果实表型是树木分类和遗传研究的重要参考指标。不少学者通过果皮或种子的遗传多样性研究，对植物种质资源利用提出了新的建议和方法[18-22]。

近年来，多位国内外学者先后对柑橘属及其近缘属的遗传多样性进行了研究[23-24]。李映志采用cpSSR和nSSR分子标记法对我国19份野生宽皮柑橘Citrus reticulata和33份地方宽皮柑橘进行品种间遗传多样性分析，发现野生柑橘的遗传多样性远大于地方宽皮柑橘[23]。Garcia-Lor等[24]采用nSSR、SNP、Indel等多种分子标记法分析了橘类种质的遗传多样性，结果表明大部分宽皮柑橘品种间均不同程度掺杂了枸橼C.medica、柚C.maxima等的基因，不同的宽皮柑橘互相杂交形成橘的部分品种。关于红河橙的研究大部分集中于分子遗传多样性分析[2-3]以及该种在柑橘分类中的系统地位[25-29]。杨杨等[2]和Yang等[3]采用ISSR分子标记的方法对云南红河地区的6个红河橙居群进行遗传多样性研究，发现红河橙的遗传多样性较高，认为红河橙遗传多样性水平较高是生境异质化和有限基因流共同作用的结果。牟凤娟等[30]对红河橙野生居群和栽培居群的叶表型性状进行了分析，发现栽培居群有8个表型性状指标的平均值大于野生居群，野生居群有5个表型性状指标的平均值稍大于栽培居群，且居群内不同叶表型变异程度不同，同一表型在不同居群间变异程度均不同。目前鲜见红河橙果实多样性方面的研究报道。本研究中对红河橙不同居群的果实表型性状多样性进行了分析，旨在为红河橙的资源利用和保育研究等提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于2019年12月初果实成熟期，对分布在云南南部的绿春县大兴镇、红河县甲寅乡、红河县大羊街乡、元江县那诺乡打芒村、元江县那诺乡猪街村等5个红河橙居群进行调查和取样。每个居群至少取样10株，不足10株时，取全部结实的植株，每个样株随机采集成熟果实，编号待用。

1.2 果实表型性状指标测定

测量果实高度、果实宽度、果皮厚度、瓢囊厚度，并计算瓢囊与果皮厚度的比值。其中，纵径为果实高度，横径为果实宽度，果皮厚度取果皮最厚处和果皮最薄处厚度的平均值，瓢囊厚度取果实髓心至内果皮距离的最大值和最小值的平均值。

收集果实瓢囊中的种子，洗净粘液后，自然风干备用。将每单株的所有种子混匀后随机取样，每个居群每个样株至少取50粒种子，分别测量种子的长度、宽度以及厚度，并计算种子长宽比值。

为简化分析，定义红河橙果实的形状表型性状包括果实高度和宽度，果皮表型性状包括果皮厚度、瓢囊厚度、瓢囊与果皮厚度的比值，种子表型性状包括种子长度、种子宽度、种子厚度、种子长宽比。

1.3 数据分析

将红河橙表型数据录入Excel 2010软件中，计算各指标值的平均值、标准差和变异系数。使用Excel 2010和SPSS 19.0软件对红河橙的各项表型指标进行系统分组设计方差分析、差异显著性检验、聚类分析以及主成分分析。系统分组设计方差分析的线性模型为

式中：Yijk为第i个居群第j个植株的第k个观测值，µ为总均值，Si为第i个居群的居群效应（固定），Tj(i)为第i个居群内单株效应（随机），ε(ij)k为试验误差。

以表型分化系数（Vst）表示居群间变异占遗传总变异的比例。

式中：为居群间方差分量，бT2为居群内方差分量。

以性状的变异系数（CV）表示性状离散程度。

CV=(Ds/V)×100%。

式中：Ds为标准差，为平均值。

2 结果与分析

2.1 不同红河橙居群果实的表型性状

5个红河橙居群果实的表型性状见表1。

表1 不同红河橙居群果实的表型性状†Table 1 Phenotypic characters of C.hongheensis fruit in different populations

由表1可知，猪街村居群的果实高度、果实宽度、瓢囊厚度、瓢囊与果皮厚度比均为最大，说明该居群果实的个头较大，出肉率较高。打芒村居群的种子长度、种子宽度为最大值，种子长宽比居第2位，种子厚度居第3位，说明该居群种子形状相对细长。种子最厚的是大兴镇居群，种子长宽比值较小，表明该居群种子最为饱满，可优先将其作为良种选育的来源。

由表1可知，红河橙9个果实表型在居群间和居群内均存在丰富的遗传变异。果实高度、果实宽度、果皮厚度、瓢囊厚度、瓢囊与果皮厚度比、种子长度、种子宽度这7个表型性状在居群间和居群内存在极显著差异（P＜0.01）；种子厚度、种子长宽比等表型在居群间存在显著差异（P＜0.05），在居群内存在极显著差异（P＜0.01）。

2.2 不同红河橙居群果实表型性状的变异分析

不同红河橙居群果实表型的变异系数见表2。由表2可知，红河橙果实形状表型、果皮表型性状的变异程度相对较大，种子表型性状的变异程度相对较小。果实形状表型和果皮表型变异系数为20.76%～31.04%，其中变异程度最大的是瓢囊与果皮厚度比（31.04%），最小为果实高度（20.76%），其变异系数均大于20%，说明不同居群的红河橙果实形状和果皮表型性状差异较大，可考虑将二者作为判别红河橙居群来源的依据。此外，红河橙果实4个种子表型性状的变异系数为13.96%～18.47%，变异系数最大的是种子长度（18.47%），最小的是种子厚度（13.96%）。

由表2可知，不同居群内同一性状也有差异。果实高度（16.62%）、果实宽度（16.57%）、瓢囊厚度（16.39%）均为大兴镇居群变异程度最大，果皮厚度（28.55%）为甲寅乡居群的变异程度最大，种子长度（15.06%）和种子宽度（21.32%）均为大羊街乡居群的变异程度最大，瓢囊与果皮厚度比（30.49%）和种子长宽比（17.45%）均为打芒村居群的变异程度最大，种子厚度（14.06%）为猪街村居群的变异程度最大。综合来看，居群内果实表型变异系数由大到小排序依次为打芒村群居群（16.83%）、大兴镇居群（15.28%）、大羊街乡居群（15.01%）、甲寅乡居群（14.07%）、猪街村居群（13.33%）。

表2 不同红河橙居群果实表型性状的变异系数Table 2 Coefficient of variation of fruit phenotypic traits in different populations of C.hongheensis %

2.3 不同红河橙居群果实表型性状的分化

不同红河橙居群果实表型的系统分组设计方差分析结果见表3。由表3可知，红河橙居群间的方差分量为24.26%～95.58%，居群内为4.39%～75.35%，表明居群间分化程度相对较高，而居群内分化程度较低。从表型分化系数来看，各性状表型分化系数为24.36%～95.61%，变异程度最大的是瓢囊厚度（95.61%），然后依次是瓢囊与果皮厚度比（93.68%）、果实高度（92.81%）和种子长度（92.51%），变异程度最小的是种子厚度（24.36%）。平均表型分化系数为75.58%，表明居群间表型分化系数为75.58%，居群内分化系数为24.42%，居群间变异是红河橙果实性状变异的主要来源。

表3 不同红河橙居群果实表型性状的系统分组设计方差分析结果Table 3 Systematic grouping design and analysis of variance of fruit traits in different C.hongheensis populations

2.4 红河橙果实表型性状的相关性分析

红河橙果实表型性状的相关系数见表4。由表4可知，红河橙果实的形状表型、果皮表型、种子表型有不同程度的关联性。其中，果实高度与果实宽度极显著正相关，果实高度和果实宽度与果皮厚度、瓢囊厚度、种子长度、种子宽度间均呈极显著正相关，瓢囊厚度与瓢囊和果皮厚度比、种子长度呈极显著正相关，种子厚度与果实形状表现相关性较小，说明红河橙果实大小和瓢囊厚度与种子大小的关系较为密切。

表4 红河橙果实表型性状的相关系数†Table 4 Correlation coefficient of fruit traits of C.hongheensis

2.5 红河橙果实表型性状的主成分分析

红河橙果实表型性状的主成分分析结果见表5。由表5可知，前3个主成分的累计贡献率达81.541%。第1主成分的特征值为4.098，贡献率为45.539%，在其特征向量中，绝对值较高的性状是果实高度（0.911）、果实宽度（0.905）、瓢囊厚度（0.827）、种子长度（0.821）、种子宽度（0.668），该类性状与果皮和种子表型有关，故第1主成分为果实形状因子。第2主成分的特征值为1.853，贡献率为20.586%，第1主成分和第2主成分的累计贡献率为66.125%。在第2主成分的特征向量中，绝对值较高的性状是瓢囊与果皮厚度比（0.815）、果皮厚度（0.805），瓢囊与果皮厚度比反映的是果实的出肉率，与果实品质有关，故第2主成分为果实品质因子。第3主成分的特征值为1.359，贡献率为15.416%，第1主成分、第2主成分和第3主成分的累计贡献率为81.541%。在第3主成分的特征向量中，绝对值最高的性状是种子长宽比（0.873），种子长宽比反映的是种子的饱满程度，与种子品质有关，故第3主成分为种子品质因子。

表5 红河橙果实表型性状的主成分分析结果Table 5 Principal component analysis of fruit traits of C.hongheensis

2.6 不同红河橙居群果实表型性状的聚类分析

基于欧式距离对5个红河橙居群的表型性状进行聚类分析，结果如图1所示。由图1可见，在欧式距离为5时，红河橙居群被分为3大类，其中第I类包括大羊街乡、甲寅乡和大兴镇3个居群，打芒村居群构成第Ⅱ类，猪街村居群为第III类。

图1 基于欧氏距离的不同红河橙居群果实表型性状的聚类分析结果Fig.1 Cluster analysis result of fruit traits of different C.hongheensis populations on Euclidean distance

红河橙的分布范围虽然较为狭窄，5个居群在地理位置上较为接近，但其3大类群的划分与其地理分布格局基本相一致。大羊街乡、甲寅乡和大兴镇3个居群的果实表型近似，在地理位置上也更为相近。该大类表现为果实形态略小，瓢囊平均厚度略小，种子较短小。元江县那诺乡的猪街村和打芒村在地理位置上较近，但其种实差异较大。猪街村居群的果实最大，种子较大，其果实皮薄肉多，较为饱满；打芒村居群的果实个头较大，在外形上呈现“扁圆”的特点，种子最大，略饱满。暴卓然等[31]报道的红河橙变种元江大翼橙果实的各表型性状特征与本研究中元江县那诺乡的猪街村和打芒村2个居群的特征相符，这2个居群与其他3个红河橙居群在果实形态上存在明显差异。

3 结论与讨论

本研究结果表明，不同红河橙居群间果实形态差异较大，遗传多样性丰富，居群间变异是红河橙遗传变异的主要来源。其中，果实高度、果实宽度、瓢囊厚度、种子长度、种子宽度等表型是红河橙居群间果实性状变异的主要表现，果实形状和果皮表型变异占了绝大部分比例，因此可将果皮表型作为种质资源评价和良种选育的主要参考指标之一。元江县那诺乡打芒村居群的果实变异最丰富，产生优质变异的可能性较高，可考虑将其作为优良种质资源选育的主要来源。

表型多样性是遗传多样性的基础，经过长期适应和自然选择，野外物种在不同居群间已经产生明显的变异和分化，各表型性状在居群内和居群间均存在丰富的遗传变异[32-33]。本研究结果表明，红河橙果实形状表型（果实高度、果实宽度）、果皮表型（果皮厚度、瓢囊厚度、瓢囊与果皮厚度比）和种子表型（种子长度、种子宽度、种子厚度、种子长宽比）在不同居群间差异显著，说明红河橙果实各表型在不同居群间存在着丰富的变异，其果实表型变异主要来源于居群间的变异，与有关麻栎Quercus acutissima[34]、丝栗栲Castanopsis fargesii[35]、文冠果Xanthoceras sorbifolium[36]以及青海云杉Picea crassifolia[37]等植物果实表型变异的研究结果相似，与板栗Castanea mollissima刺苞的刺束长度变异的研究结果不一致，后者居群内变异是其表型性状呈多样性的主要来源[38]。本研究中，红河橙不同居群间果实形状表型和果皮表型的多样性普遍高于种子表型多样性，果实9个表型性状的变异系数为13.96%～31.04%，表明红河橙多样性水平普遍较高，与杨杨等[2]和Yang等[3]的研究结果相一致。

同一物种在不同居群间发生的变异可以反映出该物种对不同环境的适应能力，物种的变异程度也表明了其适应不同生境的广泛程度，通常变异程度较大的物种，其适应的生境也越广[11]。红河橙果实各表型在居群之间的差异显著或极显著，其主要原因可能是受自身的遗传组成和生境的共同影响，说明红河橙果实这9个表型性状的多态性较为丰富，是红河橙适应环境的具体表现。此外，红河橙的种子长度、种子宽度、种子厚度这3个性状的平均值分别是16.52、11.24、5.60 mm，相应的变异系数分别为18.47%、17.65%、13.96%，牟凤娟等[39]报道西双版纳地区分布的大翼厚皮橙这3个性状的平均值分别为15.30、6.97、3.89 mm，相应的变异系数分别是10.10%、11.37%、12.34%，与之相比，红河橙种子更大、更饱满，变异程度更丰富，且5个居群间的遗传多样性水平较高。

据报道，文冠果的株高、地径、叶长、叶宽、果横径、果纵径、种子长、种子宽等21个表型性状间的变异明显，且单株种子质量与多个性状间存在显著相关性[40]。相关分析结果表明，红河橙仅种子长度和种子宽度与果实形状和瓢囊厚度有极显著或显著相关性，其余各指标间相关性较小，说明种子表型的遗传多样性可能受基因调控的影响更显著，受环境影响较小，还有待进一步从其他角度进行深入研究。

主成分分析是在不损失或较少损失原来表型性状信息的情况下将形态学信息通过降维的方法，分类出若干个综合因子来反映原先具有众多性状变量的信息量，从而简化形态学的分类工作[40]。本研究中通过对5个不同来源的红河橙果实的9个表型性状进行主成分分析，结果表明前3个主成分的累计贡献率达81.541%，其中果实高度、果实宽度、瓢囊厚度、种子长度、种子宽度等表型是红河橙果实性状变异的主要表现，且果实形状表型和果皮表型变异占了绝大部分比例，这种现象是否为环境饰变产生的结果有待进一步证实[41]。

聚类分析结果表明，在欧氏距离为5时，不同地区的红河橙被分为3个大类。第Ⅰ类包括红河县大羊街乡、红河县甲寅乡、绿春县大兴镇3个居群，该类群表现为果实略小，瓢囊平均厚度较薄，种子较短小，形态略微不饱满，特别是大兴镇居群，其种子最小，推测该3个居群的红河橙种质来源与元江县那诺乡2个居群不同。第II类为元江县那诺乡打芒村居群，其果实变异程度最大，变异最为丰富，果实高度和宽度的平均值较大，在外形上呈现“扁圆”的特点，种子长度和宽度最大，厚度适中，从该居群筛选出优质资源的可能性较高，可考虑将其作为优质种质选育材料的重要来源。第III类为元江县那诺乡猪街村居群，其果实最大，种子较大，果实皮薄肉多、形态饱满，可以考虑将其作为中药“枳壳”的材料来源[29]。

花、叶、果、种子等为植物的重要器官，进行表型研究时应尽可能涵盖这些器官的性状。本研究中仅涉及红河橙果实的形状表型、果皮表型和种子表型，还应从花、叶及植株等多项表型进行更深入的研究。同时，生境对表型的影响较大，仅通过表型性状对红河橙进行多样性研究存在一定的局限性。后续考虑将表型研究与基因水平的研究相结合，综合分析红河橙的遗传多样性，并对红河橙野生资源进行深入调查研究。