外施铵态氮水平对银杏叶生长、生理和品质的影响

高 文，花 蕊，郁万文

（南京林业大学 南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037）

银杏叶中类黄酮有调节血脂、抗氧化、抗炎症、增强机体免疫等作用[1]，具有重要的药用价值[2]。研究银杏叶中黄酮积累的影响因素，对叶用银杏的选育和栽培管理有重要的指导意义。植物体内黄酮类化合物合成代谢的起初源为光合产物[3]，有效光合作用有利于银杏叶片中黄酮的积累[4]。氮素是植物需求量最大的矿质元素，植物根系吸收的无机态氮素有硝态氮和铵态氮，其中硝态氮是植物利用的主要氮素形态，在水淹地或还原性较强的土壤中，铵态氮是主要氮素形态[5-6]。氮素的吸收积累会影响植物的生长发育[7]，直接或间接影响植物体内的光合作用[8]，进而影响黄酮的合成积累。低氮促进了类黄酮物质的积累，高氮则抑制类黄酮物质的合成，但在不同植物中不同类黄酮物质的变化并不相同[9]。前人研究结果表明，在银杏叶片生长后期施用氮肥将降低叶黄酮含量[10]，但有关该时期增施不同形态氮肥对叶黄酮含量影响的研究鲜见报道。本研究中通过分析银杏叶生长、生理指标对不同外施铵态氮水平的响应，以及不同外施铵态氮水平处理下叶黄酮含量的变化，研究外施铵态氮水平对银杏叶生长、生理及叶品质的影响及其生理机制，以期阐明铵态氮通过影响光合作用进而影响叶黄酮积累的生理过程，为叶用银杏的氮肥管理提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2020年在南京林业大学白马基地（119°19′E，31°61′N）进行试验。以未经施肥处理的2年生半同胞家系银杏幼苗为试材。试验用聚乙烯塑料盆上口径30 cm，下口径25 cm，高27 cm，底部带孔，盆下配有托盘防止养分流失。栽培基质为黄壤土，土壤理化性质为全氮含量5.454 g/kg，全磷含量0.952 g/kg，全钾含量10.865 g/kg，铵态氮含量3.002 mg/kg，硝态氮含量6.129 mg/kg，pH 6.45。

1月选择长势均一、无病虫害银杏苗移栽于塑料盆中，每盆装10 kg黄壤土。银杏苗栽植后，置于通风良好的遮雨棚内进行缓苗，常规管理4个月左右，5月中旬转移到温室大棚内，适应1周后进行施肥试验。

1.2 试验设计

试验采用完全随机区组设计。结合银杏生长中的实际需氮特点，配制的氮肥设置4个铵态氮水平，每盆的总氮量分别为0 g（CK）、1 g（NH1）、2 g（NH2）、4 g（NH4），铵态氮（NH4+-N）均由分析纯(NH4)2SO4提供，其他元素含量均相同。每个处理重复4次，每重复15株。除氮素形态配比处理外，所有盆栽苗随机摆放，互不遮挡。2020年5月25日傍晚，采取一次性施肥处理，将各处理每盆所需要肥料使用分析天平称量并溶解于300 mL蒸馏水中，依次浇入盆土中。整个试验过程中进行定期定量浇水及除草常规管理等。

陈再兴等[11]经研究发现，银杏叶片总黄酮含量、总黄酮醇苷含量、萜类内酯含量分别在8、5、6月最高，叶片最佳采收期应在5—8月。丁银花等[12]也认为6—8月采收银杏叶较为合适。因此，本试验中于8月25日9:00—10:00，随机采集幼苗中部功能叶片，对银杏叶片生长、生理和品质指标进行测定和评价。

1.3 指标测定

1.3.1 叶性状指标

每个重复随机取5株，按照上、中、下部位，各选取3片叶测定单叶干质量和单叶面积，计算比叶干质量（单叶干质量和单叶面积的比值）。

1.3.2 叶生理指标

采用无水乙醇提取法提取叶绿素[13]，测定提取液在470、474、485、645 nm波长下的吸光值，计算叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素、类胡萝卜素的含量[14]。硝酸还原酶（NR）活性采用双抗体夹心法测定。硝态氮（NO3－-N）、铵态氮含量采用紫外分光法测定[15]。N含量采用凯式定氮法测定，P含量采用钼锑抗比色法测定，K含量采用火焰光度法测定[16]。

1.3.3 叶黄酮含量

参照文献[17]中的方法并略有改动，对银杏叶片黄酮醇苷类成分（槲皮素、山奈酚和异鼠李素[18]）的含量进行测定。以C18柱为色谱柱，以甲醇与0.4%磷酸的混合溶液（体积比50∶65）为流动相；检测波长360 nm，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 µL，注入液相色谱仪，测定槲皮素含量（C槲皮素）、山奈酚含量（C山奈酚）和异鼠李素含量（C异鼠李素），按下式换算成总黄酮含量（C总黄酮）：

C总黄酮=(C槲皮素+C山奈酚+C异鼠李素)×2.51。

1.4 数据分析

使用Excel 2016、SPSS 25.0软件进行数据处理和统计分析，采用Duncan’s新复极差法进行多重比较，采用Spearman方法进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 外施铵态氮水平对银杏叶各生长指标的影响

外施铵态氮水平对银杏叶片各生长指标的影响如图1所示。由图1可见，外施铵态氮水平对银杏单叶干质量、单叶面积和比叶面积有显著影响（P＜0.05），单叶干质量、单叶面积、比叶干质量均随外施铵态氮水平的上升呈单峰趋势，NH2处理时达到最高值，较CK分别显著提高了36.38%、27.94%、6.52%。这表明适宜的外施铵态氮水平对银杏叶片的生长有促进作用。

图1 不同外施铵态氮水平处理下银杏叶片各生长指标Fig.1 Growth indexes of G.biloba leaves under different levels of ammonium nitrogen

2.2 外施铵态氮水平对银杏叶各生理指标的影响

2.2.1 对光合色素含量的影响

叶绿素是叶片进行光合作用的主要物质基础，其含量可作为反映植物光合作用能力的重要指标[19]，叶绿素含量下降表明叶片开始衰老[20]。8月，不同外施铵态氮水平处理下银杏叶片光合色素含量如图2所示。由图2可见，外施铵态氮水平显著影响银杏叶片叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和总叶绿素的含量（P＜0.05），随外施铵态氮水平的升高均呈单峰趋势，在NH2处理时达到峰值，并与其他处理有显著差异，但其他处理间无显著差异。这表明适宜的外施铵态氮水平能显著提高银杏叶片的光合色素含量，延缓叶片衰老。

图2 不同外施铵态氮水平处理下银杏叶片光合色素含量Fig.2 Photosynthetic pigment content of G.biloba leaves under different ammonium nitrogen levels

2.2.2 对硝态氮、铵态氮含量及硝酸还原酶活性的影响

硝态氮在硝酸还原酶、亚硝酸还原酶（NIR）作用下转变为铵态氮，铵态氮再循环转变为可被植物直接利用的有机态氮[21]。8月，不同外施铵态氮水平处理下银杏叶片硝态氮、铵态氮含量及硝酸还原酶活性如图3所示。由图3可见，外施铵态氮水平显著影响了银杏叶片的硝酸还原酶活性（P＜0.05）。CK处理下，银杏叶片硝酸还原酶活性显著高于其他处理，且随着外施铵态氮水平的升高，硝酸还原酶活性下降。不同处理下，银杏叶片铵态氮含量和硝态氮含量的差异显著（P＜0.05），且随外施铵态氮水平的升高，铵态氮和硝态氮的含量均显著升高，NH4处理较CK处理显著增长了166.10%、24.67%。CK处理下，叶片硝态氮含量高于铵态氮含量，其余处理下，叶片硝态氮含量低于铵态氮。

图3 不同外施铵态氮水平处理下银杏叶片硝态氮、铵态氮含量及硝酸还原酶活性Fig.3 Nitrate nitrogen, ammonium nitrogen content and nitrate reductase activity of G.biloba leaves under different external ammonium nitrogen levels

可见，施用铵态氮提高了银杏叶片铵态氮的含量，使铵态氮含量与硝态氮含量的比例增高，但施用铵态氮使硝酸还原酶活性降低，引起硝态氮的还原性减弱[22]，因而硝态氮含量升高。

2.2.3 对氮磷钾含量的影响

不同外施铵态氮水平处理下银杏叶片氮磷钾含量如图4所示。由图4可见，外施铵态氮水平显著影响了银杏叶片氮、磷的积累量（P＜0.05），对钾的积累量影响不显著（P＞0.05）。随外施铵态氮水平的升高，银杏叶片氮含量显著升高，NH4处理中叶片氮含量较CK处理显著提高了25.09%；NH2处理下，银杏叶片磷含量最高，显著高于其他处理；银杏叶片钾含量呈单峰趋势，NH2处理时达到峰值。可见，施入铵态氮显著促进了银杏叶中氮、磷的积累，同样促进了钾的积累，但影响不显著。

图4 不同外施铵态氮水平处理下银杏叶片氮磷钾含量Fig.4 Contents of NPK in G.biloba leaves under different levels of ammonium nitrogen

2.3 外施铵态氮水平对银杏叶黄酮含量的影响

8月，不同外施铵态氮水平处理下银杏叶黄酮含量如图5所示。由图5可见，外施铵态氮水平显著影响银杏叶片的黄酮醇苷类成分和总黄酮含量（P＜0.05），槲皮素、山奈酚含量均随外施铵态氮水平呈逐渐上升的趋势，且均在NH4处理达到峰值。异鼠李素含量随外施铵态氮水平升高呈先上升、再下降的趋势，在NH2处理时最高，较CK处理增加10.20%。银杏叶片的总黄酮含量随外施铵态氮水平升高呈先下降、再上升的趋势，在NH4处理时最高，较CK处理增加28.54%。

图5 不同外施铵态氮水平处理下银杏叶黄酮含量Fig.5 Flavonoid content of G.biloba leaves under different ammonium nitrogen levels

可见，8月，施入适宜水平的铵态氮能显著提高银杏叶片的黄酮醇苷类成分和总黄酮的含量，施入过高或过低水平的铵态氮均会使异鼠李素含量显著降低。

2.4 银杏叶片黄酮含量与其生长及生理指标的相关性

对银杏叶片黄酮含量指标（槲皮素含量、山奈酚含量、异鼠李素含量、总黄酮含量）与其生长及生理指标（单叶干质量、单叶面积、比叶干质量、叶绿素a含量、叶绿素b含量、类胡萝卜素含量、总叶绿素含量、硝酸还原酶活性、硝态氮含量、铵态氮含量、N含量、P含量、K含量）的相关性进行分析，结果见表1。

由表1可知，黄酮醇苷类成分及总黄酮的含量与单叶干质量、单叶面积、比叶干质量、K含量及总叶绿素含量均无显著相关性，槲皮素含量与叶绿素a、类胡萝卜素含量呈显著或极显著负相关（P＜0.05或P＜0.01），与硝态氮、铵态氮含量呈极显著正相关（P＜0.01）；山奈酚含量与硝态氮、铵态氮、N含量呈极显著正相关（P＜0.01）。异鼠李素含量与叶绿素b含量、硝酸还原酶活性、P含量呈显著或极显著正相关（P＜0.05或P＜0.01）；总黄酮含量与类胡萝卜素含量呈极显著负相关（P＜0.01），与硝态氮、铵态氮含量呈极显著正相关（P＜0.01）。

表1 银杏叶片黄酮含量与其生长及生理指标的相关系数†Table 1 Correlation coefficient between flavonoids content in G.biloba leaves and their growth and physiological indexes

由此说明，除单叶干质量、单叶面积、比叶干质量、K含量、总叶绿素含量外，其他生理指标均与总黄酮及黄酮醇苷类成分含量存在相关关系。

2.5 外施铵态氮水平对银杏叶生长、生理和品质影响的综合评价

因各指标在不同处理间的变化趋势不一致，为了更好地评价外施铵态氮水平对银杏叶生长、生理和品质的影响，筛选出适用于叶用银杏栽培的外施铵态氮水平，将测定的17个指标进行主成分分析，结果见表2。由表2可知，第1主成分的特征值为8.641，方差贡献率为50.828%；第2主成分的特征值为6.536，方差贡献率为38.446%；第3主成分的特征值为1.824，方差贡献率为10.727%。前3个主成分的累计贡献率达到100%（＞85%），表明前3个主成分代表了17个指标100%的综合信息，因此，前3个主成分可以较好反映所测定17个指标的相对重要性和各指标间的关系。

表2 外施铵态氮水平对银杏叶生长、生理和品质影响的主成分荷载矩阵及方差贡献率Table 2 Principal component load matrix and variance contribution rate of the effects of external ammonium nitrogen levels on the growth,physiology and quality of G.biloba leaves

以X1、X2、X3……X17分别代表单叶干质量、单叶面积、比叶干质量、叶绿素a含量、叶绿素b含量、类胡萝卜素含量、总叶绿素含量、硝酸还原酶活性、铵态氮含量、硝态氮含量、氮含量、磷含量、钾含量、槲皮素含量、山奈酚含量、异鼠李素含量、总黄酮含量等指标原始数据的标准化值，以F1、F2、F3分别代表第1、2、3主成分的得分，根据特征向量矩阵得到各主成分得分的线性方程：

F1=0.936X1+0.907X2+0.922X3+0.980X4+0.977X5+0.928X6+0.979X7-0.422X8+0.237X9+0.298X10+0.315X11+0.798X12+0.994X13-0.266X14-0.117X15+0.444X16-0.165X17；

F2=0.269X1+0.377X2-0.077X3-0.189X4-0.212X5-0.229X6-0.194X7-0.806X8+0.970X9+0.942X10+0.946X11-0.302X12+0.065X13+0.828X14+0.981X15-0.495X16+0.885X17；

F3=-0.225X1-0.188X2-0.378X3+0.069X4+0.031X5+0.295X6+0.060X7+0.415X8+0.050X9+0.154X10-0.075X11+0.521X12-0.085X13+0.494X14+0.154X15+0.747X16+0.436X17。

根据上述线性方程分别计算各主成分的得分，以每个主成分的贡献率作为权重，计算各处理的综合得分。3个主成分的权重值分别为50.828%、38.446%、10.727%，综合得分计算公式为F=50.828%F1+38.446%F2+10.727%F3。外施铵态氮水平对银杏叶生长、生理和品质影响的综合评价结果见表3。由表3可知，各外施铵态氮水平处理对银杏叶生长、生理、品质影响的综合得分由大到小依次为NH2、NH4、NH1、CK，说明外施铵态氮水平能有效调控银杏叶片的生长、生理和品质，外施铵态氮水平为2 g/盆时银杏叶的综合表现更佳。

表3外施铵态氮水平对银杏叶生长、生理和品质影响的综合评价结果†Table 3 Comprehensive evaluation of effects of ammonium nitrogen level on growth, physiology and quality of G.biloba leaves

3 结论与讨论

氮元素是木本植物生长发育所需的大量元素之一，氮的供给水平影响了木本植物生长发育的许多生理过程。吴家胜等[23]的研究结果表明，氮的增施对银杏叶产量、单叶面积及单叶质量等均有良好的促进作用，每株3 g为最佳施氮量。铵态氮和硝态氮均可为植物的生长发育提供充足的氮源[24]。本研究结果表明，施加适宜水平的铵态氮可显著提高银杏单叶面积、单叶干质量和比叶干质量，促进银杏叶片生长，且各生长指标均在每盆施氮量为2 g时达到最高值。

光合作用是植物重要的生理过程，是植物生长发育的基础。前人经研究发现，氮素可以通过影响传导CO2的能力调控光合速率[25]，施氮可降低光合底物传输过程中的非气孔限制，提高叶片的光合能力，延长高光合持续期[26]。氮素还可以通过影响植物叶片含氮量直接影响植物的光合作用[27]。氮素是叶绿素的主要构成元素，施加氮素可以促进叶绿素的合成[28]。本研究结果表明，施入适宜水平的铵态氮能提高银杏叶的光合色素含量，延缓叶片衰老，最佳外施铵态氮水平为每盆2 g，过多则会抑制光合色素的合成代谢。叶绿素含量可作为反映植物光合作用能力的重要指标[19]，施入适宜水平的铵态氮可提高银杏叶片的光合能力，这与吴楚等[29]的研究结果一致。铵态氮能抑制植物对硝态氮的吸收[29]，降低硝酸还原酶活性[30]。本研究结果表明，施加适量铵态氮能提高植物体内铵态氮水平，降低硝酸还原酶活性，使硝态氮的还原性减弱，导致硝态氮含量上升，进而增加植物体内氮含量。提高叶片氮含量能够提高植物叶片的光合效能[28]，同样验证了施入适宜水平的铵态氮提高了银杏叶片的光合效能。施入适量的铵态氮同样促进了银杏叶片磷、钾的积累，但对钾含量的影响不显著。叶片中氮、磷、钾、铁、镁等营养元素会对光合生理过程产生直接影响[31]。

氮肥是影响植物黄酮类物质含量的重要因素。Larbat等[32]的研究结果表明，低氮胁迫增加了番茄根、茎、叶中黄酮的含量；Strissel等[33]的研究结果表明，大量施氮降低了苹果叶片中类黄酮物质的含量。低氮促进植物黄酮类物质积累，高氮抑制黄酮类物质合成，但在不同的植物中具体变化不相同[8]。在对银杏的研究中，吴家胜等[23]的研究结果表明，适宜的施氮量可以提高银杏苗木叶片的黄酮总量，缺氮或施氮过量均不利于叶片黄酮的积累，1.5 g/株施氮量的处理中叶片各黄酮类物质含量和黄酮总量最大。本研究结果表明，在银杏生长高峰期（5月下旬）施加适当水平的铵态氮能显著提高银杏叶片黄酮类物质的含量，这与前人的研究结果基本一致[34]。

植物的各种生理过程对其次生代谢产生影响[35-36]。相关性分析结果表明，总黄酮或黄酮醇苷类成分含量与叶绿素b含量、硝酸还原酶活性、硝态氮含量、铵态氮含量、氮含量、磷含量呈显著正相关，说明随着外施铵态氮水平的上升，银杏叶片的叶绿素含量和营养元素氮、磷的积累增加，从而进一步提升银杏叶黄酮的含量。采用主成分分析法提取3个主成分，进行综合排名，结果表明每盆施入总氮量2 g处理的综合得分最高，该处理能有效促进银杏叶片的生长，提高银杏叶片的铵态氮含量、硝态氮含量、氮磷钾含量、硝酸还原酶活性等生理指标，并且显著提高黄酮类物质含量。所以，在叶用银杏的栽培管理中，适宜的铵态氮施肥水平为2 g/盆。

本研究中重点关注了银杏苗叶片对外施铵态氮的生理响应，得出有利于银杏生长发育及黄酮积累的适宜外施铵态氮水平。但当铵态氮为单一氮源时，植物需消耗大量能量进行氮素转化，而硝态氮与之相反，可以减少能量消耗。硝态氮和铵态氮共同配合的情况下，植物的生长发育更好[25]。因而还应继续探究适宜的外施硝态氮水平，并在此基础上筛选适用于叶用银杏的最优硝铵配比。