外周血淋巴细胞亚群绝对值和功能的动态监测在肾移植术后早期病毒感染风险预测中的价值

张倩倩 谢亚龙 汪峰 罗颖 陈松 张伟杰 昌盛

器官移植术后免疫状态监测对于移植物和受者的存活至关重要[1]。目前临床上常用的免疫状态评估手段如免疫抑制剂血药浓度测定、外周血淋巴细胞亚群分型检测、细胞因子定量、移植物病理活组织检查等既无法实现个体的精细化评估，也无法预估免疫功能异常[2-7]。

近来多项研究发现，干扰素（interferon，IFN）-γ是少有的可由各种淋巴细胞分泌的细胞因子[8]，用于评估淋巴细胞活性和功能、移植物功能障碍，预测移植排斥反应以及感染性疾病的预后[9-12]，相较于其他细胞因子更具有代表性。IFN-γ的分泌能力可作为反映各种淋巴细胞功能的良好标志物[13]。

我们在前期研究中开发了使用全血代替外周血 单 个 核 细 胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）、基于分析佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）/离子霉素（ionomycin）刺激下各淋巴细胞亚群产生IFN-γ能力的标准测定方法[14]，这是国内首创的流式检测淋巴细胞免疫功能技术，该方法能够同时评估CD4+T细胞、CD8+T细胞和自然杀伤（natural killer，NK）细胞功能，并且简单、快速、安全、重复性好，具有重要的临床应用价值[15]。相较于其他评估肾移植受者免疫状态的方法，本研究中采用的方法可以更精确地反映受者的免疫状态。在本研究中，通过分析华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所95例肾移植受者外周血淋巴细胞亚群绝对值及其IFN-γ分泌功能，探讨其在肾移植受者术后早期低免疫状态下对病毒感染风险的预测及诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本前瞻性观察队列研究于2018年6月至2020年12月在华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所纳入了95例同种异体肾移植受者。根据受者术后的免疫状态，分为稳定组（77例）和感染组（18例），稳定组受者无感染或排斥反应发生，感染组受者为病原学、影像学或者临床表现考虑病毒感染，如巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）或BK病毒（BK virus，BKV）感染。其中稳定组男41例，女36例，年龄（42±11）岁；感染组男9例，女9例，年龄（42±12）岁，18例受者术后感染发生时间为81（67，90）d。本研究中所有受者均签署了书面知情同意书，研究方案得到了湖北省卫生计生伦理委员会的批准。

1.2 研究方法

1.2.1 诊断标准 符合以下1项或多项标准者，诊断移植后病毒感染：（1）血液或尿液样本中病毒IgM抗体（CMV IgM、BKV IgM）阳性；（2）血液或尿液样本中病毒DNA（CMV DNA、BKV DNA）阳性；（3）伴有明显间质性肺炎的症状如发热、低氧血症，同时白细胞计数、C-反应蛋白、降钙素原升高以及有双肺间质性改变的影像学证据，并且在更昔洛韦抗病毒治疗后临床症状缓解，影像学间质性病变逐渐吸收。

1.2.2 纳入和排除标准 纳入标准：（1）ABO血型相容肾移植；（2）初次肾移植（年龄18～65岁，性别不限）；（3）术前补体依赖细胞毒性试验（complement dependent cytotoxicity，CDC）、群体反应性抗体（panel reactive antibody，PRA）均为阴性。排除标准：（1）高致敏肾移植；（2）多器官联合移植或多次移植；（3）既往有输血史或结核、肝炎病史；（4）术后6个月内有轻微尿路或上呼吸道感染；（5）临床考虑免疫抑制剂毒性反应；（6）术后6个月内发生排斥反应。

1.2.3 检测方法 采集受者外周血样标本进行流式细胞检测的时间点为术前，术后2周、1个月、2个月、6个月，发生感染时重复采集血标本。采用FACSCalibur流式细胞仪进行检测，具体的检测方法参考前期研究[14]。

1.3 免疫抑制方案

采用巴利昔单抗或抗胸腺细胞球蛋白（antithymocyte globulin，ATG）诱导治疗，序贯以钙调磷酸酶抑制剂（calcineurin inhibitor，CNI）[他克莫司（tacrolimus，Tac）或环孢素（ciclosporin，CsA）]+霉 酚 酸（mycophenolic acid，MPA）+糖皮质激素三联免疫抑制方案维持治疗。术后6个月内Tac目标血药谷浓度维持在7～8 ng/mL； CsA目标血药谷浓度维持在200～250 ng/mL，峰浓度维持在1 000～1 200 ng/mL。

1.4 研究内容

分析比较两组CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞绝对值的动态变化；通过检测IFN-γ+CD4+T细胞、IFN-γ+CD8+T细胞、IFN-γ+NK细胞比例分析两组受者淋巴细胞亚群功能；评估淋巴细胞亚群数量和功能在肾移植术后对免疫状态低下的受者病毒感染的预测和诊断价值。

1.5 统计学方法

采用SPSS 26.0软件和GraphPad Prism 8.02软件进行统计学分析和绘图。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，非正态分布的计量资料以中位数（下四分位数，上四分位数）表示。采用重复测量方差分析比较不同时间点稳定组和感染组淋巴细胞亚群绝对值及其IFN-γ分泌功能的波动和差异，当交互作用有统计学意义时，采用秩和检验分析单独效应。采用logistic回归和受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线下面积来评估淋巴细胞亚群绝对值和IFN-γ分泌功能对肾移植受者术后早期发生病毒感染的诊断价值。检验水准α=0.05，多重比较采用Bonferroni法校正。

2 结 果

2.1 稳定组和感染组受者淋巴细胞亚群绝对值的动态变化

稳定组和感染组的CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞绝对值均随着术后时间的延长而出现显著的波动（均为P＜0.05）。肾移植术后，稳定组受者的淋巴细胞亚群绝对值下降，在术后2周CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞绝对值最低，之后逐渐升高；术后6个月时，CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞绝对值均明显高于术前水平（均为P＜0.05/10，图1）。

图1 稳定组和感染组肾移植受者淋巴细胞亚群绝对值的比较Figure 1 Comparison of absolute values of lymphocyte subsets in kidney transplant recipients of stable and infected groups

淋巴细胞亚群绝对值和时间点之间存在交互效应，感染组的CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞绝对值的波动幅度高于稳定组（均为P＜0.05）。在病毒感染时，感染组的CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞绝对值整体处于相对较低的水平。在术后2个月时，感染组的CD4+T细胞、NK细胞绝对值均低于稳定组；在术后6个月时，感染组的CD4+T细胞、CD8+T细胞绝对值均低于稳定组（均为P＜0.05，图1）。

2.2 稳定组和感染组受者淋巴细胞亚群功能的动态变化

稳定组和感染组的IFN-γ+CD4+T细 胞、IFN-γ+CD8+T细胞、IFN-γ+NK细胞比例均随着术后时间的延长而出现显著的波动（均为P＜0.05，图2）。肾移植术后，稳定组受者的淋巴细胞亚群功能下降，在术后2周降至最低，之后逐渐升高；术后6个月，IFN-γ+CD4+T细胞比例尚未恢复至术前水平（P＜0.05/10）。

图2 稳定组和感染组肾移植受者淋巴细胞亚群功能的比较Figure 2 Comparison of function of lymphocyte subsets in kidney transplant recipients of stable and infected groups

淋巴细胞亚群功能和时间点之间存在交互效应，感染组的IFN-γ+CD4+T细胞、IFN-γ+CD8+T细胞、IFN-γ+NK细胞比例的波动幅度高于稳定组（均为P＜0.05）。感染组在病毒感染时，IFN-γ+CD4+T细胞、IFN-γ+CD8+T细胞、IFN-γ+NK细胞比例均处于相对较低的水平，尤以IFN-γ+CD8+T细胞比例降低最为显著。在术后2个月，感染组的IFN-γ+CD8+T细胞、IFN-γ+NK细胞比例显著高于稳定组；在术后6个月，感染组的IFN-γ+CD4+T细胞、IFN-γ+CD8+T细胞比例均高于稳定组（均为P＜0.05）。

2.3 淋巴细胞亚群绝对值和功能在肾移植术后对病毒感染的预测和诊断价值

logistic回归分析结果证实，术后2个月IFN-γ+CD8+T细胞比例升高与术后2～6个月内病毒感染风险的增加相关[比值比（odds ratio，OR） 1.096，95%可信区间（confidence interval，CI） 1.059～1.132，P=0.023]，IFN-γ+NK细胞比例升高也与病毒感染风险增加相关（OR1.198，95%CI1.039～1.398，P=0.003），其他指标与病毒感染风险无显著相关性（均为P＞0.05，图3A～D）。

图3 淋巴细胞亚群绝对值和功能预测病毒感染的logistic回归分析Figure 3 Logistic regression analysis of absolute values and function of lymphocyte subsets to predict viral infection

ROC曲线结果表明，淋巴细胞亚群绝对值联合其IFN-γ分泌功能对于免疫状态低下的受者病毒感染的诊断价值（ROC曲线下面积为0.90）显著高于单用淋巴细胞亚群绝对值（ROC曲线下面积为0.77）（P＜0.05，图4 A～C）。在结合淋巴细胞亚群绝对值和功能模型中，只有CD4+T细胞绝对值、IFN-γ+CD4+T细胞比例、IFN-γ+CD8+T细胞比例和IFN-γ+NK细胞比例对于评估病毒感染的发生发展有统计学意义（均为P＜0.05，图4A），而其他指标无统计学意义。

图4 淋巴细胞亚群绝对值和功能诊断肾移植受者病毒感染的ROC曲线图4 ROC curves of absolute values and function of lymphocyte subsets in diagnosing viral infection in kidney transplant recipients

3 讨 论

移植受者的免疫状态受到各种因素的多重影响，这使得优化免疫抑制方案更加困难[16]。许多研究指出监测受者的淋巴细胞功能具有优化免疫抑制方案的巨大价值[17-20]。IFN-γ在移植中的不同作用受到广泛关注，它对免疫状态的调控作用取决于其结合的炎症因子、诱导性趋化因子、体内平衡因子和结构性因子的水平和差异，其分泌水平可在很大程度上反映受者的免疫状态[21]。既往研究中有报道采用酶联免疫斑点试 验（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）检测CD4+T细胞分泌IFN-γ的量作为预警肾移植术后急性排斥反应的指标[22]，但是ELISPOT流程复杂耗时，且无法区分具体淋巴细胞亚群，缺乏对T细胞反应进行分类的临界值，使其临床应用受到限制[23]。

我们在前期研究中使用PMA/离子霉素刺激全血4 h，继而采用流式细胞术同时检测CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞分泌IFN-γ的能力。结果表明IFN-γ的分泌与CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞的活化、趋化和细胞毒作用均密切相关，相比于其他指标，其能更好地代表免疫功能，对评估受者的免疫状态具有重要意义[14-15]，目前已作为我院检验科常规临床检测项目开展。

本研究中，我们针对肾移植受者进行了一项前瞻性观察队列研究，对纳入的98例受者使用流式细胞术分析其术后6个月内外周血淋巴细胞亚群绝对值和功能，并重点关注有临床症状和肺部影像学表现的病毒感染受者。稳定组淋巴细胞亚群绝对值和功能在术后下降，术后2周处于最低水平，考虑到大部分受者在诱导治疗中静脉注射了直接杀伤淋巴细胞的药物（ATG和白细胞介素-2受体拮抗剂），引起T细胞耗竭，这一发现并不意外[24]。随后，淋巴细胞亚群绝对值逐渐恢复，甚至超过术前水平，但功能在术后6个月时仍未完全恢复，说明淋巴细胞亚群绝对值和功能的恢复并不一致，淋巴细胞亚群功能的恢复可能需要更长时间。

感染组CD4+T细胞绝对值在术后各时间点始终稍低于稳定组，且在病毒感染时达到最低，说明CD4+T细胞绝对值的减少与病毒感染的发生相随。T细胞在移植免疫中起着重要的调控作用，在宿主抵抗感染性病原体方面发挥核心作用[25-28]。另有文献指出，肾移植术后T细胞计数恢复延迟与术后感染风险的增加相关[29-30]，并提出外周血淋巴细胞亚群的动态监测可能有助于指导更昔洛韦预防治疗的持续时间[31]。

病毒感染受者在术后6个月（此时感染的治疗已经结束，患者处于康复期）的IFN-γ+CD4+T细胞比例、IFN-γ+CD8+T细胞比例显著高于稳定组受者。这可能与CD4+T细胞、CD8+T细胞应答的潜在保护作用有关。 此外，术后2个月时，我们在一些急性病毒感染受者中观察到IFN-γ+CD8+T细胞、IFN-γ+NK细胞比例明显升高，这也可能是CD8+T细胞和NK细胞免疫活化和功能亢进的证据[32]。

需要指出的是，感染组在病毒感染时，CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞绝对值整体处于相对较低水平，但并非所有受者淋巴细胞亚群绝对值均降低；然而几乎所有病毒感染受者的IFN-γ+CD4+T细胞、IFN-γ+CD8+T细胞、IFN-γ+NK细胞比例均明显降低。此外，logistic回归结果证实，术后2个月时，IFN-γ+CD8+T细胞比例和IFN-γ+NK细胞比例的升高与病毒感染风险的增加相关；ROC曲线分析表明，淋巴细胞亚群绝对值与功能结合对肾移植受者病毒感染的诊断价值高于单用淋巴细胞亚群绝对值。这些结果都表明了淋巴细胞亚群功能更能准确、直接反映受者的免疫抑制程度。对于移植受者来说，如果淋巴细胞功能已经受损，增加的淋巴细胞数量并不一定与受者免疫功能的提高相关[14,32]。因此，监测淋巴细胞功能对病毒感染的早期预警很重要，将淋巴细胞亚群绝对值和功能监测相结合可为移植术后病毒感染的早期预警和个体化治疗方案提供更清晰和精确的参考[33-34]。

综上所述，本研究详细评估了不同免疫状态下肾移植受者术后6个月内的淋巴细胞亚群绝对值和功能的变化，发现病毒感染的受者淋巴细胞亚群功能与稳定组相比有显著差异。单独分析CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞绝对值在预测受者处于低免疫状态所致病毒感染风险方面临床价值较小，而同时监测淋巴细胞亚群绝对值和功能可使受者免疫状态的评估更加精细。因此，建议在肾移植术前基线测定淋巴细胞亚群绝对值和功能，在术后6个月内至少每月监测1次淋巴细胞亚群绝对值和功能，这样的动态监测有助于及早发现受病毒感染的移植受者，从而指导临床个体化用药和早期干预。