谷氨酸、γ-氨基丁酸在偏头痛模型PAG和TNC中的变化

张先元 张路平 陈强 严民力 周会霞 曹志坚 章正祥*

偏头痛是一种以单侧搏动性疼痛为主的头痛病，常常反复发作，严重影响生活。其发病机制尚不明确，可能与脑干下行疼痛调节系统有关，该系统包括中脑导水管周围灰质（periaqueductal gray，PAG）、三叉神经脊束核尾侧亚核（caudal spinal trigeminal nucleus，TNC）等［1］。偏头痛发作间期进行磁共振弥散张量成像，发现三叉神经脊束核和PAG表现出更大的平均扩散率［2］，磁共振波谱发现谷氨酸（glutamate，Glu）和γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）存在异常［3］。Glu、GABA分别是神经系统主要的兴奋性神经递质和抑制性神经递质，两者之间调节异常可引起慢性疼痛［4］。本研究旨在探讨偏头痛模型PAG和TNC中的Glu及GABA变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级别SD雄性大鼠30只，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2013-0016，动物合格证编号：2008001670602。分笼饲养于浙江中医药大学动物实验中心，自由取食、饮水。本实验经浙江中医药大学动物实验研究中心批准（动物实验设施使用许可证编号：2016143），动物实验条件合格证号：SYXK（浙）2013-0184。

1.2 药物与试剂 硝酸甘油（批号：20150814，北京益民药业有限公司）；重水（批号：MKBW4494V，美国Aldrich公司）；利扎曲普坦（批号：20160419，湖北欧力制药有限公司）；甲醛溶液（批号：20170412，上海凌峰化学试剂有限公司。

1.3 实验器材 冰冻切片机（型号：HM 550 VPD，美国Thermo SCIENTIFIC公司）；600 M核磁共振波谱仪（型号：600 MHz/AVANCE HD，瑞士BRUKER公司）；5 MM核磁管（型号：WG-1000-7，美国WILMAD公司）。

1.4 实验方法 （1）分组、给药与造模：30只大鼠采用Excel软件完全随机设计的分组方法分为对照组、模型组和西药组，每组各10只。对照组、模型组灌胃超纯水，西药组灌胃利扎曲普坦（溶于超纯水配成0.102 mg/mL浓度），给药剂量1 mL/100 g，每日上午1次，连续灌胃7天。在第7天灌胃结束后，于透明钢化玻璃箱（30 cm×30 cm×40 cm）中适应0.5 h，然后于上午9：30～10：00进行造模，对照组腹腔注射生理盐水，模型组、西药组腹腔注射浓度5 mg/mL硝酸甘油，给药剂量0.2 mL/100 g。（2）行为学录制与福尔马林实验：腹腔注射药物5 min后，于玻璃箱中观察大鼠的行为学表现，保持周围环境安静，用高清摄像机录制4 h行为学视频。行为学录制结束后，在大鼠左后爪的中间跖区域皮下注射100 μL的1%福尔马林（甲醛稀释于0.9%生理盐水），注射完成后立即放入铁架上的玻璃箱中，通过下方45°斜放的镜面反射大鼠足部动作，用摄像机录制大鼠足部行为1.5 h。（3）取PAG与TNC：足部行为录制结束后，予各组大鼠1%戊巴比妥钠0.5 mL/100 g麻醉。取出脑组织，在低温环境下分离出脑干，放入液氮中运输至实验室，再将脑干置于-20 ℃的冰冻切片机上，根据《大鼠脑立体定位图谱》（第6版）进行特定核团的定位，进一步分离出PAG与TNC，所有组织存于-80 ℃冰箱。（4）核磁共振波谱代谢组学：①取出TNC和PAG用电子天平称重并记录；②样品放入含有600μL 0.05% TSP-d4重水的研磨管中研磨，随后转移至直径5 mm的专用核磁管中；③采用Bruker AVANCE ⅢTM 600 MHz（14.09T）核磁共振波谱仪主机，配备5 mm-BBFO探头，D2O锁场，自动匀场后，采用noesypr1d序列获得压水峰图谱，获取时间1.7 s，采集次数128次，数据点32 K，扫描时间约8.9 min；④测量的代谢物包括肌酸（Cr）、GABA、Glu，采用Bruker Topspin 3.2获取原始数据；⑤利用波谱分析处理软件MestRe Nove处理FID文件，进行傅里叶变换、相位校正和基线校正，以三甲基硅烷丙酸酯（TSP）为内标，TSP化学位移为0.00 ppm；⑥计算相关代谢物绝对浓度：CM=AM/ATSP*fP*CTSP*MWM/WM，再进一步校正TSP和重量因素，绝对浓度=CM/TSP/体重，表示为cGABA、cGlu；⑦计算代谢物相对浓度：相关代谢物绝对浓度与Cr的比率视为相对浓度，表示为rGABA、rGlu。1.5 统计学方法 采用SPSS 25.0统计软件。计量资料符合正态分布以（±s）表示，多组间比较采用单因素设计方差分析，组间两两比较采用LSD法；不符合正态分布以［M（P25，P75）］表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis H法，两两比较采用all pairwise。采用广义线性混合效应模型分析不同部位脑代谢产物的区别。根据数据分布特点，cGlu光谱数值取lg值，表示为lg（cGlu）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组的脑代谢产物比较 对照组RTNC一个样本丢失，一个样本数据图形差，所以只有8个样本可进行分析。PAG内rGlu的组间比较差异有统计学意义（P=0.034），模型组较生理盐水组减少（P=0.031），西药组与模型组比较有增多趋势，但差异无统计学意义（P=0.288），其余脑代谢物质值组间比较均无统计学差异（P＞0.05）。见表1～4。

表1 三组的cGABA值比较

表2 三组的cGlu值比较

表3 三组的rGABA值比较

表4 三组的rGlu值比较

2.2 脑代谢产物在不同部位的区别 对cGABA、cGlu、rGABA、rGlu进行广义线性混合效应模型分析。cGABA组间无统计学差异（F=0.252，P=0.778），部位之间有统计学差异（F=136.459，P＜0.001）；与RTNC的cGABA（Coefficient=0）相比，PAG的cGABA值更高，差别有统计学意义（PAG Coefficient=0.261，tPAG=12.483，P＜0.001），而LTNC的cGABA值无统计学差异（LTNC Coefficient=-0.026，tLTNC=-1.410，P=0.162）。cGlu组间无统计学差异（F=0.095，P=0.910），部位之间有统计学差异（F=32.118，P＜0.001）；与RTNC的cGlu（Coefficient=0）相比，PAG的cGlu值更高，差异有统 计 学 意 义（PAG Coefficient=0.146，tPAG=6.762，P＜0.001），而LTNC的cGlu值无统计学差异（LTNC Coefficient=-0.016，tLTNC=-0.644，P=0.522）。rGABA组别与部位有交互效应（F=2.957，P=0.025），单独分析各个部位的组间差异，结果显示PAG、RTNC、LTNC的组间差异均无统计学意义（P＞0.05）。rGlu组间无统计学差异（F=2.117，P=0.127），部位之间有统计学差异（F=3.798，P=0.026）；与RTNC的rGlu（Coefficient=0）相比，PAG的rGlu值更高，差别有统计学意义（Coefficient=0.040，tPAG=2.736，P=0.008），LTNC的rGlu值无统计学差异（Coefficient=0.016，tLTNC=0.905，P=0.368）。

3 讨论

Glu和GABA是偏头痛的重要神经递质，与头痛的发生与终止密切相关［5］。TNC和PAG是偏头痛的重要疼痛结构。本研究模型组PAG的Glu较对照组减少，而GABA无明显变化，因此重点围绕Glu进行讨论。

PAG是疼痛调节的关键结构［6］，主要负责疼痛感知的下行调节［7］。PAG-中缝大核回路是偏头痛主要的下行疼痛调节通路。PAG通过Glu激活中缝核，中缝核激活脑啡肽神经元，从而抑制C纤维疼痛信号传入［7］。中缝大核将下行纤维投射到TNC。研究发现，偏头痛大鼠模型中PAG、中缝大核和TNC内的c-Fos阳性细胞数显著增加，实验结果可见PAG被激活的细胞数较TNC多［8］。本研究发现，PAG的Glu含量较TNC多，提示PAG在偏头痛中扮演着更重要的角色。有研究发现，若腹外侧PAG的谷氨酸能神经元通过化学遗传操作被激活，可抑制伤害感受，但不是所有腹外侧PAG 的谷氨酸能神经元亚群都有镇痛作用，和此作用相关的是投射到延髓头端腹内侧区（RVM）的亚群［9］。2020年，HOSSEINI等发现PAG中代谢型谷氨酸受体亚型8的活化通过调节RVM off细胞活性来改善痛阈。从以上研究可见，谷氨酸是PAG调节疼痛的重要神经递质。2005年，ISHIDE等发现对大鼠后肢进行机械刺激可激活C纤维，使PAG内的Glu增加，进一步研究发现L-精氨酸渗入PAG双侧后，会使机械刺激诱导的Glu释放减少。本研究对大鼠腹腔注射硝酸甘油后，用福尔马林对足部进行疼痛刺激，结果发现PAG的Glu释放减少。这两个研究有一个共同点，即一氧化氮（nitric oxide，NO）在其中发挥介导作用。NO在体内主要来自于精氨酸［10］，硝酸甘油也是NO的供体［11］，NO升高可诱发偏头痛，使用硝酸甘油制备偏头痛模型是经典的造模方法。大鼠注射硝酸甘油后，在体内转化生成NO，进而作用于PAG，使福尔马林诱导的Glu释放减少，进一步导致PAG内Glu的镇痛作用减弱［12］，因为Glu可诱导神经元一氧化氮合酶释放NO［13］，本研究结果还提示NO和Glu之间可能存在负反馈调节机制。利扎曲普坦是临床上用于治疗偏头痛的5-HT 1B / D受体激动剂，虽然西药组PAG内的Glu和模型组比较无统计学差异，但也存在升高趋势，可能与5-HT 1B / D受体激动剂可以降低大鼠脑中NO含量的作用有关［10］。TNC是三叉神经通路的二级伤害感受神经元。偏头痛的发作最有可能起源于下丘脑，并激活TNC［14］。1987年，MAGNUSSON等发现谷氨酸能三叉神经丘脑投射神经元主要分布在三叉神经感觉主核，三叉神经脊束极间亚核，而在TNC分布较少。2006年，OSHINSKY等研究发现TNC细胞外Glu增加的时间过程与大鼠面部感觉阈值的变化有关。2014年，OSHINSKY等在慢性三叉神经痛大鼠模型上腹腔注射硝酸甘油后，发现TNC上的Glu明显增加。也有研究显示，通过注射硝酸甘油获得偏头痛模型的面部疼痛阈值无明显变化［15］。本研究发现，偏头痛模型TNC上的Glu无明显变化，可能是因为造模后面部疼痛阈值无变化，并且本研究未对大鼠面部进行任何疼痛刺激。结合既往研究认为，TNC的Glu主要参与面部疼痛的调控。

综上所述，PAG在偏头痛中发挥着重要作用，硝酸甘油可能通过NO影响PAG内Glu的释放，进而影响对疼痛的反应，为偏头痛患者镇痛能力减弱的现象提供了一种解释［16］，下一步将会进行NO如何调控PAG的Glu的研究。本研究PAG与TNC的GABA绝对浓度不同，但相对浓度无差异，虽然这两个部位的GABA未受到硝酸甘油明显影响，但是GABA和疼痛密切相关，还需进一步完善GABA在其他偏头痛相关结构中的研究。