丽江山慈姑种子无菌萌发和组培快繁技术研究※

●张祖珍 李 疑 阮金华 王安东 卢 兵

（1.云南新兴职业学院 云南 昆明 650501；2.昆明海盛园艺有限公司 云南 昆明 651700；3.楚雄仙草园生物科技有限公司 云南 昆明 675000）

丽江山慈姑（Iphigenia indicaKunth et Benth）是百合科（Liliaceae）丽江山慈姑属（Iphigenia）的干燥鳞茎，又叫益辟坚、草贝母、山慈姑等，主要分布于我国云南西北至中部（鹤庆、丽江、昆明）、四川、西藏等地，多生于海拔1950～2100 m 的松林下、草地或田野[1]。1974年，丽江山慈姑以山慈姑为药材名收入《云南省药品标准》，药用部位为其鳞茎[2-3]。丽江山慈姑中含有秋水仙碱等多种生物碱，可作为提取秋水仙碱的原料药材，研究表明，秋水仙碱在临床上可用于癌症和痛风的治疗，对炎症、疼痛、肝硬化、急性痛风、急性痛风性关节炎等疾病也有很好的治疗 效果[4-5]。

丽江山慈姑在植物形态学上表现为生长发育缓慢、根系不发达、抗逆性差、种子休眠期长、种壳坚硬、通透性差等特点，由于在自然条件下难以打破其休眠状态，导致其萌发率极低，近年来过度采挖更加剧了其濒危现状[6]。另外，由于丽江山慈姑种子萌发时间过长，因而不利于大面积推广。对于丽江山慈姑的组培扩繁，Mukhopadhyay等[7-8]研究表明，可以采用丽江山慈姑的鳞茎作为外植体来启动组培，但此方法获取丽江山慈姑种苗成本较高。为缩短丽江山慈姑的种苗获取时间并节约成本，本试验通过对丽江山慈姑种子无菌萌发，进而获得小鳞茎并扩繁，以期满足市场对丽江山慈姑的需求，并为野生资源和濒危品种保育提供理论参考。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 种子及试剂 种子选自丽江山慈姑成熟蒴果，慈姑蒴果为2019年11月采集于云南省丽江市玉龙县石鼓镇仁义村。由大理大学段宝忠副教授鉴定标本，种子置于4℃条件下 保存。

试剂有3%过氧化氢、2% NaClO溶液、BAP、 Kinetin、MS培养基组成试剂、蔗糖、琼脂、 1 mol/L HCl溶液、1 mol/L NaOH溶液及其他植物组培常用试剂。

1.1.2 培养基准备 按表1配方配制不同的培养基，即全量MS、MS（1/2 NH4NO3）和1/2MS的培养基，分别命名为G1、G2及G3。

表1 培养基基础配方 单位：mg/L

1.2 试验步骤

试验步骤如图1所示。

图1 丽江山慈姑种子无菌萌发和组培快繁技术试验步骤

1.3 试验方法

1.3.1 种子脱毒和接种 将采集的种子蒴果经脱水干燥后，在解剖显微镜下检查果皮破损情况并筛选出20颗均匀饱满的蒴果，根据图2操作流程进行分组。

图2 蒴果消毒处理及接种操作流程

脱毒操作后每颗蒴果分别接种于萌发培养基G1、G2和G3组7～8瓶，后置于温度20℃、光照强度2100 lx、光照时长 12 h/d的条件下培养。

污染率从接种后第3天开始统计，到第3周周末结束，计算公式如下：

污染率（%）=污染接种瓶瓶数/总接种瓶瓶数×100。

1.3.2 萌发试验 每组分别取适量培养基加入浓度分别为0，0.1，0.3，0.6 mg/L的BAP，每升培养基加入蔗糖30 g并搅拌溶解，利用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH将pH调至5.8，每升培养基加入6 g琼脂粉后煮沸，后将培养基分装于组培瓶中，每瓶各50 mL，并标记时间和培养基名称，并在120℃、0.15 MPa条件下灭菌22 min，冷却备用。

将未感染细菌或真菌的培养瓶按BAP浓度梯度随机各选取6瓶，分别于接种后的第10周和第15周在超净工作台内的解剖镜下进行观测，以能明显辨认出种子吸胀后根部出现小鳞茎及真叶为标准，统计萌发种子数。种子萌发率公式：种子萌发率（%）=萌发种子数量/总接种数×100。

1.3.3 增殖培养和温室移栽 选取最适萌发培养基在不同浓度BAP和Kinetin（简称KT）单一或结合条件下使用，将其命名为增殖培养基组M1、M2及M3，通过增殖培养和温室移栽，筛选BAP及KT的最适浓度。种子萌发后经过4个月的培养，长出直径5 mm小鳞茎的幼苗。在20℃、光照2100 lx 14 h/d培养条件下，探索以小鳞茎为外植体的最适宜增殖的植物激素水平。

2 结果与分析

2.1 2% NaClO溶液不同浸泡时间对种子萌发污染率的影响

使用2% NaClO溶液对丽江山慈姑种子进行不同时间的浸泡，种子萌发污染率，见表2。丽江山慈姑蒴果在D1和重复D2两组处理中结果均表明被真菌和细菌的污染概率随2% NaClO溶液浸泡时间的延长而降低，处理时间为2 min时，在接种后的第4天有超过50%的种子开始出现明显真菌污染；最佳处理时间为10 min，污染率在7%以下。

表2 2% NaClO溶液不同浸泡时间对种子萌发污染率的影响

2.2 不同培养基对种子萌发率的影响

根据种子萌发率筛选最适萌发培养基及BAP浓度。结果表明，种子萌发率随培养时间延长逐渐升高，随着BAP浓度的升高而降低，这说明BAP会抑制种子萌发（表3）。在BAP浓度和培养时间一致的情况下，对比萌发培养基组G1、G2和G3可知，培养基内大量元素的浓度对种子萌发也有较大影响，大量元素如硝酸铵减半，对萌发率影响较小，而当大量元素均减半时，萌发率有所提高，说明低浓度的无机盐对丽江山慈姑种子萌发具有促进作用。结果表明，最适宜萌发条件为不含BAP的1/2MS培养基中培养15周，萌发率70.52%。种子萌发过程及生长情况如图3所示。

图3 显微镜下观察丽江山慈姑种子萌发及生长情况

表3 第10周和第15周种子萌发率统计结果

2.3 增殖培养和温室移栽结果与分析

通过萌发试验可知，当培养基以1/2MS为基础时有助于小鳞茎和叶子成长，通过3个周期的继代培养，发现增殖率随着BAP浓度升高而升高；随着KT的浓度升高而升高，但当KT浓度为0.5 mg/L时出现玻璃化。当BAP和KT同时使用，在两者浓度均为0.1mg /L时得到最高的增殖倍数，为1.85（表4）。将第二、三周期继代分别得到289株和447株小鳞茎直径＞5 mm且具有两片叶子的小苗（图4）分别进行了温室移栽炼苗测试。

图4 增殖阶段和待移栽苗

表4 不同植物激素浓度对丽江山慈姑鳞茎增殖倍数的影响

通过将直径＞5 mm的小鳞茎分别移栽入细河沙和木屑、细河沙和椰糠珍珠岩两组基质内，经过3个月的炼苗驯化成活率，发现小苗成活率均在70%以上；在椰糠与珍珠岩比例为2∶1的基质中成活率最高，为87.27%（表5）。说明通过上述组培技术手段获得的幼苗可以保证移栽成活率。

表5 温室移栽基质及成活率

3 结论与讨论

丽江山慈姑无菌萌发可以解决其种子自然萌发率低的问题。本试验通过对丽江山慈姑蒴果的脱毒、萌发、增殖扩繁以及移栽驯化可知，在组培技术条件下可以在1年的时间内获得大量直径为3～5 mm小球茎，带叶子的无菌幼苗；最佳萌发条件为不添加BAP的1/2MS培养基，经过15周的培养萌发率最高可达70.25%；最佳增殖条件为BAP和KT相结合使用，在两者浓度均为 0.1 mg/L时得到最高的增殖倍数，为1.85；温室移栽成活率是其鳞茎规模化生产的关键，本试验结果表明炼苗移栽时，在透气性较好的椰糠和珍珠岩以2∶1配比条件下成活率较高， 为87.27%。

植物组培技术的优势在于短期内可以得到大量无菌完整植株，在本研究的基础上仍有许多可以优化的地方，如不同植物激素配比、不同光温培养条件、培养基成分调整、培养周期及继代数对增殖率和植株生长的影响等有待研究，并且通过调整驯化环境，如不同栽培基质、穴盘移栽、光温水肥调控等提高成活率和快速 生长。