点带石斑鱼致病性哈维氏弧菌的分离鉴定及药敏试验

裴立硕，朱永龙，毛晴，陈丽梅，郭永军，孙敬锋

点带石斑鱼致病性哈维氏弧菌的分离鉴定及药敏试验

裴立硕，朱永龙，毛晴，陈丽梅，郭永军，孙敬锋通信作者

（天津农学院 水产学院 天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300392）

为探究养殖点带石斑鱼死亡原因，从患病点带石斑鱼（）肝脏中分离得到一株细菌，命名为SBY-G。经形态学观察、生理生化试验鉴定，初步判定为哈维氏弧菌（）。基因序列分析显示，菌株SBY-G与哈维氏弧菌菌株（KU364055.1）相似性最高，基因序列分析显示，菌株SBY-G与哈维氏弧菌菌株（LC370081.1）相似性最高，系统发育树显示与哈维氏弧菌聚为一支，因此确定该菌为哈维氏弧菌（）。药敏试验结果表明，菌株SBY-G对阿莫西林、头孢孟多、头孢克肟、头孢曲松、诺氟沙星等15种抗生素高度敏感；对头孢噻肟、庆大霉素、卡那霉素等6种抗生素中度敏感；对氨苄西林、苯唑西林、头孢呋辛、头孢他啶、链霉素、新霉素等18种抗生素不敏感。人工回归感染试验结果显示，菌株SBY-G对斑马鱼的半数致死量LD50为1×105cfu/g。本研究结果为哈维氏弧菌感染引起鱼类疾病的防治和诊断提供了科学参考。

哈维氏弧菌；；；药敏试验

点带石斑鱼（），属于鮨科，石斑鱼亚科，石斑鱼属。因其肉质鲜美，营养丰富，是经济价值较高的海水名贵种类[1]。近年来随着养殖技术的发展，人工养殖石斑鱼规模不断扩大，成为继大黄鱼、鲆鱼和鲈鱼后的第四大类海水养殖品种[2]。但是在人工养殖过程中，由于密度过大，水体污染严重等原因，鱼类机体抵抗力下降，为细菌侵入创造了有利条件[3]。已有报道指出溶藻弧菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌等都可以导致海洋经济动物大量死亡[4]。并且，在石斑鱼养殖过程中，弧菌与石斑鱼溃疡病有着直接的关系[5]。

弧菌病是严重危害海水养殖鱼类的疾病之 一[6]。哈维氏弧菌为弧菌属的一种，是目前海水鱼虾养殖过程中常见的条件致病菌，给我国水产养殖业造成巨大损失[7]。目前，已在大黄鱼[8]、长牡蛎[9]、大菱鲆[10]、半滑舌鳎[11]等海洋经济动物中分离到哈维氏弧菌。

近期，天津市某养殖场点带石斑鱼出现皮肤溃疡症状，为研究其病因，本实验室对患病鱼进行了致病菌的分离鉴定。在患病石斑鱼肝脏组织中分离到一株细菌，通过细菌形态学观察，生理生化试验，、基因序列分析鉴定为哈维氏弧菌，并进行了人工回归感染和药敏试验。研究结果为鱼类感染哈维氏弧菌的防治提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料

患病点带石斑鱼（体长（10±2）cm）取自天津市某海水鱼养殖场；健康斑马鱼（体长（3.5± 0.2）cm）购自天津市某花鸟鱼虫市场；2216E培养基、细菌生化鉴定管和药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司；PCR Master Mix试剂购自北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离纯化

取患病石斑鱼肝脏、脾脏、肾脏组织，在2216E固体平板上划线分离，28 ℃恒温培养18 h。从脾脏和肾脏组织没有分离得到细菌，观察从肝脏组织分离细菌的菌落形态，挑取优势菌落进行3次划线分离，获得纯培养的菌株SBY-G，加入同等体积40％甘油混合保种，-20 ℃保存。

1.2.2 生理生化特性

无菌条件下挑取单菌落接种于微生物生化鉴定管中，进行生理生化特性鉴定。接种后鉴定管于28 ℃恒温培养24～48 h后观察结果。将获得的菌株生理生化特征对比《伯杰细菌鉴定手册》[12]及《常见细菌系统鉴定手册》[13]中标准菌株的结果来初步判定菌株属种。

1.2.3、基因序列分析

采用水煮法[14]提取DNA，以此作为模板进行、基因序列PCR扩增。PCR扩增反应体系（25 μL）包括：DNA模板2 μL，超纯水11 μL，PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各 1 μL。PCR扩增反应条件：首先95 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性1 min，56 ℃（）/ 50 ℃（）退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；最后在72 ℃再延伸10 min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，然后送至天津金唯智生物科技有限公司进行测序。将测序结果通过NCBI的Blast检索系统进行相似性分析，使用MEGA 6.0软件采取Neighbor-Joining 法构建系统发育进化树。

1.2.4 人工回归感染试验

健康斑马鱼（体长（3.5±0.2）cm）购自天津某花鸟鱼虫市场，在实验室观察饲养1周，确认健康无病后，用于人工回归感染试验。随机选取70条健康斑马鱼，平均分为6个试验组和1个对照组，试验组的斑马鱼分别腹腔注射浓度为1×104、1×105、1×106、1×107、1×108和1×109cfu/mL的菌液，每一个体注射剂量为10 μL，对照组注射相同体积的0.9％生理盐水。连续观察7 d，每天记录各组斑马鱼的死亡情况，采用Bliss法[15]算出半数致死量LD50。

1.2.5 药敏试验

采用药敏纸片法[16]进行药敏试验。在无菌条件下将菌液均匀涂布于2216E固体培养基上，用镊子顺时针依次贴入含有各种抗生素的药敏纸片，恒温培养24 h后，测量抑菌圈直径并取平均值，根据药敏纸片说明书，判定该菌对抗生素药物敏感性。

2 结果与分析

2.1 细菌分离纯化及生理生化特性

从患病石斑鱼肝脏组织中分离纯化得到一株细菌，命名为SBY-G。该菌在2216E培养基上生长良好，菌落表面光滑，边缘规整，中部略突起，呈乳白色。菌株SBY-G生理生化结果显示，与麦芽糖、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、蔗糖、蕈糖、鼠李糖等反应为阳性；与硫化氢、阿拉伯醇、蛋白胨水、水杨素、七叶苷等反应为阴性（表1）。

表1 菌株SBY-G的生理生化试验结果

注：“＋”表示阳性；“－”表示阴性

2.2 16SrDNA、gapA基因序列及系统发育树分析

2.2.1序列及系统发育树分析

测序结果显示，菌株SBY-G的序列长度为1 397 bp（图1），Blast对比结果表明该菌株的序列与哈维氏弧菌菌株KU364055、KU245727、KF607055的相似性高达99.93％，系统发育树结果显示菌株SBY-G与哈维氏弧菌自然聚为一支（图2）。

注：图中M为Marker

2.2.2基因序列及系统发育树分析

测序结果显示，菌株SBY-G的基因序列长度为766 bp（图3），Blast对比结果表明该菌株的基因序列与哈维氏弧菌菌株LC370081、EF596108、DQ184650的相似性分别为100.00％、99.86％、99.87％，系统发育树结果显示菌株SBY-G与哈维氏弧菌自然聚为一支（图4）。

注：图中M为Marker

2.3 人工回归感染试验

用SBY-G菌株腹腔注射感染斑马鱼后，第二天，斑马鱼开始出现发病死亡的现象。死亡的斑马鱼发病症状与患病石斑鱼症状特征相似，表现为胸鳍发红（图5A），腹部发红、皮肤溃烂（图5B）。累计观察7天后，不同浓度感染组均出现死亡现象，且感染浓度为1×107、1×108、1×109cfu/mL的感染组斑马鱼死亡率高达80％以上 （表2）。SBY-G菌株对斑马鱼半数致死量（LD50）为1×105cfu/g。

注：A为胸鳍发红；B为腹部发红、皮肤溃烂

表2 人工回归感染试验结果

2.4 药敏试验结果

药敏试验结果表明，菌株SBY-G对阿莫西林、头孢孟多、头孢克肟、头孢曲松、美罗培南、阿奇霉素、诺氟沙星、利福平等15种抗生素高度敏感；对头孢噻肟、庆大霉素、卡那霉素等6种抗生素中度敏感；对氨苄西林、苯唑西林、青霉素G、哌拉西林、头孢呋辛、头孢他啶、链霉素、新霉素、四环素等18种抗生素不敏感 （表3）。

注：R表示不敏感；I表示中度敏感；S表示敏感

3 讨论

随着我国水产养殖业不断发展，近年来，由于片面追求经济效益，和环境恶化等原因，水产养殖病害呈上升趋势，水生动物病害时有发生，给水产养殖业造成了巨大的经济损失[17-18]。哈维氏弧菌是近年感染水产养殖动物常见的致病菌之一，感染凡纳滨对虾[19]、豹纹鳃棘鲈[20]、鲍鱼[21]等都引起严重的疾病。本研究中，患病石斑鱼临床症状主要表现为表皮溃烂，腹部发红、溃烂，胸鳍发红，初步认为是细菌引发的该疾病，故采用传统细菌分离鉴定法进行研究。从病鱼肝脏中分离一株革兰氏阴性菌，经细菌形态观察、生理生化试验、和基因序列及系统发育树分析鉴定为哈维氏弧菌。

常规的生化指标只能进行初步的判定，对于生理生化相似度较高的细菌较难做出正确的鉴 定[22]，基因具有高度保守性，常用来对细菌进行分类鉴定，但对于亲缘关系比较近的细菌分辨率不高，有时只能在属的水平上区分细 菌[23]。基因是原核和真核生物中广泛存在的看家基因，具有高度的保守性，不同种属细菌之间又存在相对稳定的变异性，近年来被广泛用于细菌的种系发生学和分类学鉴定[24-26]。本试验中采用基因序列分析对菌株SBY-G进一步鉴定，其结果与序列分析结果一致。

人工回归感染试验结果表明，菌液浓度达到1×107cfu/mL时，试验组斑马鱼的死亡率已达到90％，浓度为1×108和1×109cfu/mL时，试验组斑马鱼死亡率均为80％。根据SANTOS等[27]提出的标准，当一种细菌对鱼类的半数致死量LD50值在1.7×104～1.0×106cfu/g这一范围时，则可以认为该菌对鱼类有高等毒性。在本试验中，菌株SBY-G的半数致死量LD50为1×105cfu/g，这表明该菌具有较高的毒力。所以，哈维氏弧菌作为一种重要的条件性致病菌，在环境应激如营养不良、水质恶化、机械损伤等不利条件下，容易引起鱼类发病。

抗生素在防治细菌感染性疾病中具有重要作用[28]，但在实际应用过程中其滥用现象愈演愈烈，不仅造成药品的浪费，还增加细菌耐药性的产生，对机体造成危害[29]。在水产养殖中，滥用抗生素会使动物体内出现药物残留，使得出产的水产品安全得不到保障[30]，本研究中，药敏试验结果显示，菌株SBY-G对氨苄西林、苯唑西林、青霉素G、哌拉西林、头孢呋辛、头孢他啶、链霉素、新霉素、四环素等18种抗生素具有抗性。所以，在点带石斑鱼养殖过程中要慎用渔用抗菌药物，防止细菌耐药性的产生和加重。据报道，大部分哈维氏弧菌菌株对氯霉素敏感[31]，而对呋喃唑酮具有较高的耐药性[32]，这与本研究结果一致。虽然部分抗生素如氯霉素、红霉素、呋喃唑酮等在水产养殖过程中已经被禁用，但研究其耐药性对哈维氏弧菌分类鉴定具有一定的参考价值[33]。同时，该研究结果还可为水产养殖动物的病害防治以及对抗生素类药物的科学规范使用提供参考。

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Isolation, identification and antibiotic susceptibility analysis of the pathogenicfrom

Pei Lishuo, Zhu Yonglong, Mao Qing, Chen Limei, Guo Yongjun, Sun JingfengCorresponding Author

（Tianjin Key Laboratory of Aqua-Ecology and Aquaculture, College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China）

To explore the cause of death ofa bacterial strain was isolated from the liver of diseasedand named as SBY-G. This bacterial strain was preliminarily determined asaccording to its morphological, physiological and biochemical characteristics.The sequence analysis of theandgenes respectively showed SBY-G had the highest similarity with（KU364055.1）and（LC370081.1）, and the phylogenic trees showed that it was clustered with. The results of antibiotic susceptibility analysis showed that SBY-G was highly sensitive to amoxicillin, cefixime, cefamandole, ceftriaxone, norfloxacin and other fifteen antibiotics, moderate sensitive to cefotaxime, gentamicin, kanamycin and other six antibiotics, while resistant to ampicillin, oxacillin, cefuroxime, ceftazidime, streptomycin, neomycin and other eighteen antibiotics. Artificial infection experiments showed that the median lethal dosage（LD50）of the SBY-G strain on zebra fish was calculated as 1×105cfu/g. The results of this study provide a scientific reference for the prevention, treatment and diagnosis of fish diseases caused by.

;;;antibiotic susceptibility analysis

1008-5394（2021）04-0035-06

10.19640/j.cnki.jtau.2021.04.009

Q959.48

A

2020-03-28

天津市自然科学基金项目（19JCZDJC34600）；天津市企业科技特派员项目（18JCTPJC64700，19JCTPJC60100）

裴立硕（1997—），女，本科在读，主要从事鱼类疾病与免疫学研究。E-mail：2440076384@qq.com。

孙敬锋（1976—），男，教授，博士，主要从事水产动物病害及免疫学研究。E-mail：sun_jf@163.com。

责任编辑：张爱婷