彩色小麦成熟胚愈伤组织诱导及再生体系优化

谭一罗，陈 凤，张广旭，王康君，郭明明，李晓峰，张梦涵，樊继伟

（连云港市农业科学院，江苏 连云港 222000）

小麦（Triticum aestivum L.）是世界主要粮食作物之一。随着人民生活水平的提高，消费者对有色食品的营养价值愈发关注，彩色小麦成为一个新的研究方向[1]。彩色小麦由于籽粒种皮或糊粉层的天然色素，呈现灰、紫、蓝和绿等特殊粒色，含有较高的微量元素以及花青素，营养价值丰富，具有良好的保健作用和开发前景[2]。

近年来，小麦转基因育种、基因编辑育种、基因功能等研究依赖小麦的高频遗传转化体系提高了育种效率[3-5]。研究表明，基因型、培养基、外植体等均会对小麦的再生效率产生影响[6-9]。幼胚是小麦良好的外植体材料，再生能力强，但是取材常受时间和季节限制；成熟胚取材方便，不受时间、环境影响，且生理状态相近，但较低的再生能力限制其在小麦遗传转化中的应用。

目前，关于普通小麦的组织培养研究较多，已经筛选出了较为合适的培养基和材料[10-12]。但是，关于彩色小麦组织培养的研究报道较少。对彩色小麦组织培养体系预试验表明，传统的分化培养基[13]对彩色小麦愈伤组织成苗效果较差，且过长的愈伤诱导时间一方面导致愈伤组织在暗培养阶段提前出芽，另一方面继代培养增加了培养基污染风险。因此，本研究拟通过优化彩色小麦愈伤诱导时间和分化培养基生长调节剂配比，筛选适合彩色小麦组织培养的基因型和培养基，以期为彩色小麦高效再生体系的建立提供理论依据，为高频遗传转化提供研究基础。

1 材料和方法

1.1 植物材料

供试材料为3 个彩色小麦品种（系），分别为中黑麦6 号（深紫粒）、CM-Z2（紫粒）和中蓝麦1 号（蓝粒）。

1.2 培养基

采用MS 作为基本培养基，通过添加部分营养元素、琼脂和生长调节剂得到诱导培养基和分化培养基。分化培养基根据生长调节剂种类、浓度和配比的不同分为6 种；生根培养基采用1/2 MS 培养基作为基本培养基，添加蔗糖、琼脂和多效唑（MET）。不同培养基按表1 配制，在灭菌前调节培养基pH 值至5.8，于121 ℃高压灭菌20 min，不可高温高压灭菌的生长调节剂采用过滤除菌，于培养基高压灭菌降至50 ℃以下单独加入。

表1 培养基编号及成分配比

1.3 方法

1.3.1 消毒 每组材料分别选择500 粒当年收获且籽粒饱满的彩色小麦种子，先用流水将种子冲洗5～10 min，并用无菌水冲洗3 遍，再用75%乙醇将种子浸泡消毒5 min，然后于0.1%氯化汞溶液浸泡消毒15～20 min，期间振荡4～5 次，最后用无菌水冲洗5 次，4 ℃条件下于无菌水中浸泡16～18 h。

1.3.2 外植体接种和诱导培养 将浸泡后的彩色小麦种子用0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min，期间每2 min 振荡1 次，然后用无菌水冲洗4 次备用。取小麦籽粒放入经121 ℃高压灭菌20 min 的垫有无菌滤纸的培养皿，用解剖刀和镊子无菌操作将籽粒的成熟胚取出。分别将成熟胚接种于诱导培养基平板，每皿约接种65 枚成熟胚，25 ℃黑暗条件下培养，14 d 进行继代培养，分别于8、14、20 d 统计愈伤诱导情况。

1.3.3 分化培养 将未提前萌发的愈伤组织转接至不同的分化培养基，25 ℃2 000 lx 光照培养，每天光照16 h，14 d 继代1 次。统计分化过程中绿点、绿芽和愈伤褐变数量。

1.3.4 生根培养 待彩色小麦再生苗生长至3～5 cm，将幼苗转接至生根培养基，于25 ℃2 000 lx 光照培养，每天光照16 h，统计成苗率。

1.4 数据处理与分析

根据试验结果计算出愈率、胚芽率、分化率、绿芽诱导率、成苗率、褐变率。

采用GraphPad Prism 5 软件进行数据分析和绘图。

2 结果与分析

2.1 基因型和诱导天数对彩色小麦出愈率的影响

由图1 可知，中黑麦6 号和CM-Z2 诱导8 d 和14 d 的出愈率有显著差异（P＜0.05），中蓝麦1 号诱导8 d 和20 d 的出愈率有显著差异（P＜0.05），说明在诱导初期出愈率随着诱导时间增加而上升；但3 个彩色小麦基因型在诱导14 d 和20 d 时出愈率均无显著差异（P＞0.05），说明出愈率随着诱导时间先上升后趋于稳定。当诱导20 d 时，中黑麦6 号、CM-Z2、中蓝麦1 号的平均出愈率分别达到96.31%、85.07%和89.61%，中黑麦6 号与其他2 个品种出愈率存在显著差异（P＜0.05），CM-Z2 和中蓝麦1 号出愈率无显著差异（P＞0.05）。

图1 基因型和诱导天数对出愈率的影响

2.2 基因型和诱导天数对彩色小麦胚芽率的影响

不同基因型和诱导天数对彩色小麦愈伤诱导阶段的胚芽率存在影响。由图2 可知，中黑麦6 号和中蓝麦1 号在愈伤诱导阶段的胚芽率随着诱导天数的增加显著增加（P＜0.05）；CM-Z2 的胚芽率虽然呈上升趋势，但无显著差异（P＞0.05）。中黑麦6 号胚芽率显著高于CM-Z2 和中蓝麦1 号（P＜0.05），诱导培养20 d 时胚芽率达到31.38%。彩色小麦成熟胚诱导14 d 后（图3），彩色小麦的愈伤组织多呈淡黄色，组织致密，中黑麦6 号有17.52%的愈伤组织在诱导培养基中提前出芽（图3a），CM-Z2 在诱导培养14 d时没有愈伤组织提前出芽（图3b），中蓝麦1 号有3.35%愈伤组织提前出芽（图3c），提前出芽的愈伤组织大多呈半透明、水浸状，且结构疏松。光学显微镜分别观察中黑麦6 号的胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织，发现胚性愈伤组织细胞呈卵圆形，排列较整齐且紧密（图3d），非胚性愈伤组织细胞形态及排列不规则且松散（图3e）。

图2 基因型和诱导天数对胚芽率的影响

图3 彩色小麦成熟胚诱导14 d 时的愈伤组织

2.3 培养基和基因型对彩色小麦分化的影响

2.3.1 IAA 和KT 不同浓度、配比对彩色小麦分化的影响 由表2 可知，中黑麦6 号在3 组IAA 和KT 不同浓度、配比培养基中分化率、褐变率均无显著差异（P＞0.05），但绿芽诱导率和成苗率在不同培养基中存在显著差异（P＜0.05）；CM-Z2 在IAA 和KT不同浓度、配比培养基中分化率、绿芽诱导率和成苗率均存在显著差异（P＜0.05）；中蓝麦1 号在IAA 和KT 不同浓度、配比培养基中分化率和成苗率均无显著差异（P＞0.05），但绿芽诱导率和褐变率在不同培养基中均存在显著差异（P＜0.05）。在0.5 mg/L IAA 和4.0 mg/L KT 处理下（A-3），中黑麦6 号、CM-Z2、中蓝麦1 号的分化率、绿芽诱导率和成苗率均达到最高，说明该培养基较为适合彩色小麦愈伤组织分化。

表2 彩色小麦在IAA 和KT 不同浓度、配比培养基中的分化情况 单位：%

2.3.2 IAA 和6-BA 不同浓度、配比对彩色小麦分化的影响 由表3 可知，中黑麦6 号在3 组IAA 和6-BA 不同浓度、配比培养基中绿芽诱导率和成苗率存在显著差异（P＜0.05）；CM-Z2 在IAA 和6-BA 不同浓度、配比培养基中分化率存在显著差异（P＜0.05），但绿芽诱导率、成苗率和褐变率在不同培养基中无显著差异（P＞0.05）；中蓝麦1 号愈伤组织在IAA 和6-BA 不同浓度、配比培养基中愈伤褐变率高，绿芽诱导率和成苗率均较低，且不同培养基无显著差异（P＞0.05）。在0.1 mg/L IAA 和0.5 mg/L 6-BA 处理下（B-1），中黑麦6 号、CM-Z2、中蓝麦1 号的成苗率均达到最高，说明该培养基较为适合彩色小麦愈伤组织分化。

表3 彩色小麦在IAA 和6-BA 不同浓度、配比培养基中的分化情况 单位：%

在培养基A-1、A-2、A-3、B-1、B-2、B-3 条件下彩色小麦分化率从高到低依次为中黑麦6 号、CM-Z2、中蓝麦1 号，且在所有培养基处理中中黑麦6 号的分化率均为最高，为87.68%～97.50%；在培养基A-1、A-2、A-3、B-1、B-2、B-3 条件下彩色小麦成苗率从高到低依次均为中黑麦6 号、CM-Z2、中蓝麦1 号，最高为中黑麦6 号，成苗率在17.26%～61.73%；其次为CM-Z2，成苗率在2.27%～34.09%，各基因型在最优培养基中成苗情况见图4，中黑麦6 号成苗率显著高于CM-Z2 和中蓝麦1 号，说明基因型对彩色小麦成苗有重要影响。

图4 彩色小麦愈伤组织在最优培养基中成苗情况

3 讨论与结论

愈伤诱导时间对小麦成熟胚的脱分化存在影响，进行组织培养时应当选择合适的诱导时间。试验结果表明，不同彩色小麦品种（系）出愈率随诱导时间增加而增加，但胚性愈伤组织数随诱导时间呈现先增加后降低的趋势。此外，在脱分化阶段愈伤组织的提前出芽与基因型有关，且培养时间过长会导致胚芽率升高。综合出愈率和形成的愈伤组织质量，彩色小麦诱导14 d 左右可以获得质量较好的胚性愈伤组织，过长时间培养难以保证愈伤组织的质量，且14 d 的愈伤诱导可以省去该阶段继代培养过程，一定程度上降低了污染风险。张月琴等[14]研究表明，小麦愈伤诱导时间为12 d 时最佳，与本研究结果相近。陆玉建等[15]研究认为，培养时间较短会导致愈伤组织结构松散，培养28 d 最适合不定芽的诱导，与本研究结果不一致，推测是由于最适愈伤诱导时间与小麦基因型有关。

本研究中，彩色小麦成熟胚分化率、绿芽诱导率和成苗率随KT 浓度增加而增加，且在4 mg/L 浓度下最佳。张月琴等[14]研究表明，KT 浓度较低时，分化率随KT 浓度成正比，当KT 浓度超过0.5 mg/L 时，分化率下降，与本研究结果不一致。周子凡等[16]研究认为，适当提高KT 浓度，有助于成苗率的提高，当KT 浓度达2 mg/L 时成苗率最大。刘君等[17]研究结果表明，在添加10 mg/L KT 和0.1 mg/L IAA 的分化培养基中小麦京411 成熟胚的成苗率高于其他培养基。因此，诱导分化的最适培养基与生长调节剂种类、配比以及材料的基因型相关。

近年来的研究表明，不同基因型之间的小麦成熟胚愈伤组织分化成苗能力差异显著，且不同的分化培养基有较大差异[18-20]。所以，选择再生能力强的小麦基因型，针对不同的基因型筛选合适的分化培养基对提高小麦遗传转化效率有重要意义。本研究中，3 种彩色小麦成苗能力从高到低依次为中黑麦6 号、CM-Z2、中蓝麦1 号，在6 种不同分化培养基中的平均成苗率分别为43.78%、11.91%、1.53%。中蓝麦1 号在6 种培养基中成苗率均较低，推测与其基因型有关。中黑麦6 号和CM-Z2 在A-3 培养基中均有较高的成苗率，说明A-3 可以作为这两个彩色小麦良好的再生培养基。此外，中黑麦6 号在含有0.1 mg/L IAA 和0.5 mg/L 6-BA（B-1）的MS 分化培养基中成苗率最高，达到61.73%，说明中黑麦6 号是彩色小麦遗传转化良好的潜在受体。本研究以彩色小麦为材料，在传统小麦组织培养体系上对愈伤诱导时间进行了改进，根据对愈伤组织状态的观察减少了愈伤诱导过程中的继代培养过程，并对分化培养基的生长调节剂类型、浓度、配比进行了优化，为彩色小麦的后续遗传转化提供了良好的供试材料和试验基础。