丹酚酸B 对大鼠睾丸缺血再灌注损伤的保护作用

庄新怡，胡嘉奕，丁璐楠，韦思明

（浙江树人大学树兰国际医学院，浙江 杭州 310015）

睾丸扭转（testicular torsion）是一个常见的泌尿科急症，在25 岁以下的男性中发病率为1/4000，它导致了睾丸缺血[1]。外科手术复位可以恢复睾丸血流，避免睾丸梗死。但是，即使成功复位，41.4%的病例仍发生了睾丸萎缩、生精功能降低[2]。睾丸扭转复位所诱导的损伤是一个典型的缺血再灌注损伤。在缺血再灌注过程中，活性氧过量产生，在睾丸损伤中扮演着一个关键的角色[3-5]。过量的活性氧，包括超氧阴离子、羟自由基和过氧化氢等，诱导细胞膜脂质过氧化、蛋白变性和DNA 断裂，最终导致了组织损伤和细胞死亡[6]。到目前为止，对于睾丸缺血再灌注损伤缺乏手术后的临床辅助治疗。据报道，丹酚酸B拥有广泛的药理活性，如抗氧化、抗感染和抗纤维化等[7，8]。已有研究证实，丹酚酸B 能减轻心脏的缺血再灌注损伤[9]。丹酚酸B 对睾丸缺血再灌注损伤的效应从来没有被研究过。本研究通过建立大鼠睾丸缺血再灌注损伤模型，探索丹酚酸B 对睾丸缺血再灌注损伤的效应及其机制，为睾丸缺血再灌注损伤的临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 60 只体重在250～300 g 的成年雄性SD 大鼠由上海斯莱克实验动物有限公司提供，丹酚酸B 和抗β-肌动蛋白（β-actin）抗体购自于Sigma 化学公司，抗环磷酸腺苷反应元件调控因子τ（cAMP-responsive element modulator-τ，CREMτ）抗体来自于Santa Cruz 生物技术公司，丙二醛分析试剂盒购自于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法 采用随机数字表法将60 只大鼠随机分成对照组、缺血再灌注组和治疗组，每组20 只。氯胺酮（50 mg/kg）腹腔内注射麻醉后，大鼠被固定在手术台上，消毒铺巾。经左侧髂腹股沟切口，取出左侧睾丸。对照组大鼠以1 根11/0 无创伤丝线穿过睾丸白膜，然后睾丸放回阴囊，缝合皮肤切口。缺血再灌注组大鼠逆时针扭转左侧睾丸720°来诱导睾丸缺血，接着用11/0 丝线固定扭转睾丸到阴囊上，维持睾丸缺血状态。2 h 后，睾丸恢复到正常位置，诱导睾丸血液再灌注。睾丸仍然存活，放回阴囊。治疗组接受了与缺血再灌注组同样的外科处理，但在再灌注时，从尾静脉注射10 mg/kg 丹酚酸B 予以治疗。灌注后4 h，每组一半大鼠的双侧睾丸被切除，用以分析丙二醛水平，然后这些大鼠通过吸入二氧化碳行安乐死。灌注后3 个月，每组剩余一半大鼠的睾丸用以评估CREMτ 蛋白表达和睾丸生精功能。

1.3 睾丸组织中丙二醛测定 睾丸组织在丙二醛裂解缓冲液中搅匀，然后组织匀浆在4 ℃以5000 r/min的速度离心15 min，获取上清液用于丙二醛的测定。用硫代巴比妥酸反应物质试验来确定睾丸组织的丙二醛含量，操作步骤按照试剂盒生产厂家的说明书进行。

1.4 CREMτ 蛋白表达的分析 参考Liu H 等[10]的方法抽提睾丸组织的蛋白。抽提的蛋白通过电泳进行分离，然后转移到硝酸纤维滤膜上。膜上的非特异性结合位点用含5%脱脂奶粉的溶液进行封闭，随后滤膜在4 ℃与CREMτ 一抗、β-actin 一抗一起孵育过夜。第2 天，滤膜在室温下与辣根过氧化物酶结合的二抗一起孵育1 h。然后用增强的化学发光探测试剂显示膜上蛋白条带，接着定量条带强度。CREMτ 条带与来自同一样本的内参照β-actin 条带的强度比值作为CREMτ 蛋白的相对表达水平。

1.5 睾丸生精功能的测定 通过测定睾丸重量、曲细精管直径、生精细胞层数和Johnsen 评分这些指标来评定睾丸生精功能。睾丸切下后在电子秤上称重，然后波恩氏液固定、石蜡包埋。从石蜡块上切下5 μm厚的薄片，脱蜡后，苏木素-伊红染色。从每一个切片上选取20 个圆的曲细精管，在显微镜下测量其直径、生精细胞层数和Johnsen 评分，然后计算其平均值。显微镜的目镜上装有测微尺，可以测量曲细精管直径；在每一个曲细精管，从基底膜到管腔计数生精细胞层数；根据生精细胞发育成度，对精子发生做Johnsen 评分。

1.6 统计学分析 用GraphPad Prism 软件（4.0 版本）来进行统计学分析。计量资料采用（）表示，使用单因素方差分析和q检验来比较组间数据，组内同侧和对侧睾丸之间的比较采用t检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组睾丸组织内的丙二醛水平比较 缺血再灌注组同侧睾丸（即左侧缺血再灌注睾丸）的丙二醛水平高于对照组、治疗组，差异有统计学意义（P＜0.05）；三组对侧睾丸（即右侧睾丸）的丙二醛水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

图1 各组睾丸组织内的丙二醛水平比较

2.2 各组睾丸CREMτ 蛋白表达比较 缺血再灌注组同侧睾丸的CREMτ 蛋白表达低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗组同侧睾丸的CREMτ 蛋白表达高于缺血再灌注组，差异有统计学意义（P＜0.05）；三组间对侧睾丸的CREMτ 蛋白表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。

图2 各组睾丸CREMτ 蛋白表达比较

2.3 各组睾丸生精功能 缺血再灌注组同侧睾丸的重量、曲细精管直径、生精细胞层数和Johnsen 评分均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗组同侧睾丸的重量、曲细精管直径、生精细胞层数和Johnsen 评分均高于缺血再灌注组，差异有统计学意义（P＜0.05）。三组对侧睾丸的重量、曲细精管直径、生精细胞层数和Johnsen 评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图3。对照组睾丸可观察到正常的曲细精管直径和生精细胞层数，在曲细精管内有许多成熟的精子和一个开放的管腔；缺血再灌注组同侧睾丸表现出曲细精管萎缩和生精细胞层数减少；治疗组同侧睾丸曲细精管的结构几乎符合正常标准，曲细精管内可见成熟的精子，但曲细精管的管腔内包含有脱落的生精细胞，见图4。

图3 各组睾丸的重量、曲细精管直径、生精细胞层数和Johnsen 评分比较

图4 各组睾丸的病理组织学切片

3 讨论

如果睾丸扭转持续超过6 h，将导致睾丸梗死[11]。即使在这段时间内行外科手术复位，患者术后仍会出现睾丸萎缩[2]。本次研究显示，单侧睾丸扭转2 h 后复位，虽然睾丸仍然存活，但复位后3 个月，睾丸生精功能严重损伤，表现为睾丸重量、曲细精管直径、生精细胞层数和Johnsen 评分降低。睾丸扭转复位后的损伤是一个典型的缺血再灌注损伤。但目前对于睾丸缺血再灌注损伤的机制仍然不明。

CREMτ 充当着男性生精细胞分化的总开关，调控着生精细胞特异基因的转录[12]。缺乏CREMτ 基因的小鼠睾丸重量减轻20%～25%，曲细精管直径降低20%～30%，精子发生停滞在早期阶段[13]。因此，CREMτ 表达对精子发育成熟必不可少。本次研究发现，单侧睾丸缺血再灌注后3 个月，同侧睾丸的CREMτ 表达降低，生精功能也严重损伤。由于CREMτ 表达对精子发育成熟必不可少[13]，所以单侧睾丸缺血再灌注后同侧睾丸CREMτ 表达的降低可能导致了睾丸生精功能的损伤。然而，CREMτ 表达降低的原因仍然不明。

活性氧包括超氧阴离子、过氧化氢和羟自由基等。活性氧具有高反应性和寿命短的特点，直接定量检测活性氧较为困难，而活性氧能引起细胞膜脂质过氧化产生稳定的末端产物丙二醛。因此，丙二醛被广泛作为一个敏感的活性氧指标[14]。本次研究发现，在单侧睾丸缺血再灌注后，同侧睾丸的丙二醛水平上升，表明睾丸缺血再灌注后会有过量的活性氧产生。活性氧可以通过调控基因的表达来影响细胞的分化[15]，结合上述的研究结果，提出以下假设：睾丸缺血再灌注后，过量产生的活性氧可能通过下调CREMτ 的表达来造成生精功能损伤。

当前，一些药物，如己酮可可碱，姜黄素和勃锐精等，已被证实在动物模型中治疗睾丸缺血再灌注损伤是有效的[16-18]。然而，目前尚无药物可用于临床治疗睾丸缺血再灌注损伤的患者。丹参是我国的传统中药，具有活血化瘀的功效，已广泛应用于心脑血管疾病（如心绞痛、心肌梗死和脑梗死等）的临床治疗中[19]。丹酚酸B 是丹参中最丰富的生物活性成分，能清除活性氧，拥有极强的抗氧化活性[20]。据报道[9]，丹酚酸B 能降低心脏的缺血再灌注损伤。然而，丹酚酸B 对睾丸缺血再灌注损伤是否有保护作用，还未见报道。本研究发现，相比于缺血再灌注组，丹酚酸B 治疗可降低同侧睾丸的丙二醛水平，提高CREMτ的表达和生精功能，证实了上述的假设。同时，这些数据还表明，丹酚酸B 通过清除活性氧来上调CREMτ 表达，从而减轻睾丸的缺血再灌注损伤。

既往研究显示[9]，丹酚酸B 在10 mg/kg 的剂量时能减轻大鼠的心脏缺血再灌注损伤。因此，本研究在大鼠睾丸缺血再灌注模型中选择了这个剂量。研究发现，相比于缺血再灌注组，10 mg/kg 的丹酚酸B 治疗可改善同侧睾丸的生精功能，但是生精功能没有恢复到正常水平。后期，本研究将进一步探索丹酚酸B 的最佳治疗剂量。

综上所述，丹酚酸B 对睾丸的缺血再灌注损伤有保护作用，其可能成为在临床上治疗睾丸缺血再灌注损伤的药物，但需要进一步的临床试验进行验证。

致谢：感谢浙江树人大学树兰国际医学院的戴欣怡、吴雨桐、柴敏娇等人在实验中的帮助。