饲用竹粉对断奶仔猪生长性能、血清生化指标和粪便微生物的影响

2022-01-10代发文苏保元姚宏明古殿超杨瑶君

动物营养学报 2021年12期

代发文林涛苏保元姚宏明古殿超杨瑶君

(1.乐山师范学院，乐山 641000；2.广安市饲料工业管理站，广安 638000；3.北京大伟嘉生物技术股份有限公司，北京 100085；4.湖南德邦生物科技有限公司，衡阳 410205)

仔猪刚断奶时面临着环境和饲粮的巨大变化，断奶应激带来的腹泻死淘和生长缓慢是养猪生产中的重点难题之一，在过去几十年主要通过在饲粮中添加抗生素来解决这些问题。随着饲用抗生素添加剂的禁用，近年来有关纤维营养在调控仔猪营养代谢[1]、十二指肠绒毛高度与隐窝深度[2-3]、消化道菌群平衡[4]和调节肠道pH[5]等方面的有益作用引起了行业高度关注。纤维营养有望成为后抗生素时代解决断奶仔猪腹泻和生长问题的有效营养策略之一，然而研究发现纤维的类型和来源对其应用效果影响较大[1,6]。与文献中报道的纤维原料菊粉、木质纤维素、苜蓿草、糖渣等相比，我国竹资源丰富，竹纤维具有良好的透气性、瞬态吸收、抗菌、抗异味以及更强的垂直和水平强度等特性[7]，但因其营养利用价值低，在单胃动物饲粮中的应用鲜有报道，主要集中在有机养殖和反刍动物应用方面[8]。

研究发现，竹叶富含竹叶黄酮[9]、竹叶多糖等，可调节动物机体的免疫功能和抗氧化能力[10]。Felisberto等[11]以不同品种嫩竹杆制作的竹粉含糖0.94%～13.40%、淀粉1.75%～16.89%、粗灰分(Ash)0.87%～2.77%、粗蛋白质(CP)1.31%～2.03%、不可溶纤维(IDF)62.54%～89.79%，有望成为淀粉和纤维来源。大熊猫作为一种典型的采食竹的动物，其对竹的消化率也非常低，对新鲜全竹的干物质消化率平均低于20%，半纤维素和纤维素消化率分别为27%和8%[12]。通过内部标记法扩大试验群体研究发现，熊猫采食全竹的粗蛋白质表观消化率为33.8%，粗纤维表观消化率为31.8%[13]。Okano等[14]发现，将竹粉碎发酵后替代绵羊部分苜蓿草豆粕型基础饲粮，与不发酵竹粉组相比，有机质(OM)、中性除残灰洗涤纤维(NDFom)、酸性除残灰洗涤纤维(ADFom)表观消化率显著增加。以3年生毛竹粉与豆渣混合发酵后饲喂羊，粗蛋白质、中性洗涤纤维(NDF)消化率与苜蓿草相当，有机质、酸性洗涤纤维(ADF)消化率低于苜蓿草[15]。上述研究表明，饲用竹粉的营养利用价值相对较低，经过发酵处理后可提高其养分利用率，有望用作反刍动物的纤维饲料原料。

目前有关饲用竹粉及其纤维制品在单胃动物中的应用研究鲜有报道。最近研究发现，竹笋壳纤维具有较强的胆固醇吸附活性和益生元潜力，可促进乳酸菌生长和增加底物可发酵性，有望作为功能性食品生产中的生物活性成分[16]。竹纤维通过增强胰岛素信号通路和激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子-1α(PGC-1α)来提高喂养高脂饲粮小鼠的胰岛素敏感性，其改善效果显著优于另一微晶纤维素[17]。竹笋壳纤维具有较好的吸水膨胀性、持水性和脂肪吸附性，可改善高脂血症老鼠的脂肪代谢紊乱，降低血清胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇含量，增加高密度脂蛋白胆固醇含量[18]。上述研究表明，竹纤维具有纤维特性和益生元作用，有望成为一种功能性原料应用于单胃动物。与竹笋壳提取的纤维相比，以竹杆制作的饲用竹粉含有一定的木质素，通过超微化可使纤维组分由不溶性向可溶性再分配，降低木质素含量，提高原料持水性和脂肪吸附性[19]。在仔猪天然污染饲粮中添加超微化小麦纤维可降低仔猪血浆、肝脏和肾脏中赭曲霉毒素A的蓄积[20]。本试验旨在评估常规竹粉(GB)和超微竹粉(SB)对断奶仔猪生长性能、血清生化指标和粪便菌群的影响，为饲用竹粉在单胃动物中的合理应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 饲用竹粉及其理化指标测定

常规竹粉：采集5～6年生楠竹竹杆(产自四川省)，去竹青后，采用切刀粉碎机(600型，郑州创一机械设备有限公司)进行粗粉，烘干至含10%～12%水分后，用锤片式粉碎机(968型，江苏牧羊集团有限公司)粉碎过80目筛。

超微竹粉：采用冲击磨粉碎机(ZJ-C100，四川众金粉体设备有限公司)对常规竹粉进一步粉碎过200目筛。

采用激光粒度分布仪(BT-9300ST，丹东百特仪器有限公司)测定饲用竹粉的粒径分布，测定累计粒度分布数50%、75%、90%、98%时所对应的粒径值D50、D75、D90和D98值。

采用蒲俊宁[21]的方法测定饲用竹粉的水分、粗蛋白质、粗灰分含量，采用Van Soest等[22]的方法测定酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维含量。常规竹粉和超微竹粉各测定3个批次样品，每个样品测定2个重复样。

1.2 体外仿生消化试验

试验分2个批次进行，首先开展常规竹粉和超微竹粉的体外仿生消化试验，对照组为常规竹粉组，试验组为超微竹粉组，每组3个重复。然后进行饲用竹粉调控断奶仔猪体外仿生消化试验，试验分为5组，对照组饲喂基础饲粮(断奶仔猪料)，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组分别在基础饲粮的基础上添加1%常规竹粉、1%超微竹粉、2%常规竹粉和2%超微竹粉，每组3个重复。试验饲粮参照NRC(2012)断奶仔猪营养需求设计和配制，其组成及营养水平见表1，不含抗生素类促生长添加剂。

表1 试验饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) %

采用体外3步模拟消化法，运用三角瓶摇床进行体外消化处理[23-24]，每个消化处理样品重量为1.000 0 g。采用烘干恒重法测定试验各组样品的体外干物质消化率(IVDMD)。

1.3 动物试验与分组

试验选择28日龄、体重[(7.88±0.58) kg]相近的健康杜×长×大断奶仔猪30头，每头仔猪耳牌编号，按体重和性别相近原则随机分为3组，每组10个重复，每个重复1头猪。对照组饲喂不含抗生素的基础饲粮，试验Ⅰ、Ⅱ组分别饲喂在基础饲粮的基础上添加1%常规竹粉和超微竹粉的试验饲粮(表1)。预试期3 d，正试期13 d。采用猪场常规饲喂管理程序进行饲养管理，按顿饲喂，每天饲喂4顿，以每顿投料后1 h料槽底部无剩余料为下顿投料标准。

1.4 动物试验样品采集与指标测定

1.4.1 生长性能

分别于试验开始和结束当天08:00称量已空腹12 h的仔猪重量，以个体为单位计算试验期间的平均日增重、平均日采食量和料重比。试验过程中所有试验猪只未发生腹泻，未进行腹泻率和腹泻程度的评定。

1.4.2 血清生化指标

试验结束当天08:00，每个试验组随机选择5头接近平均体重的仔猪，前腔静脉采集血液置于带盖离心管中，3 000 r/m离心10 min，分离血清，于-80 ℃冷冻保存待测。采用试剂盒法测定血清胆固醇、甘油三酯、葡萄糖、尿素氮的含量，试剂盒均购自江苏酶免实业有限公司。

1.4.3 粪便样本采集

试验结束前1天08:00，同组内随机收集2头仔猪的新鲜粪便合并为1个样品，每个试验组收集3个样品，每个样品约20 g，液氮速冻，-80 ℃冷冻保存待测。

1.4.4 粪便细菌计数

取粪便样品0.5 g于无菌三角瓶，采用灭菌生理盐水逐级10倍稀释，将稀释液接种于相应的固体培养基上。每种指标检测5个稀释梯度，每个梯度设3个重复。大肠杆菌、总需氧菌于37 ℃有氧培养24 h后计数，乳酸杆菌37 ℃厌氧培养48 h后计数。

1.4.5 粪便菌群组成检测

将组内3个平行粪便样本，进行等量均匀混合为单份样本，并采用细菌基因组DNA试剂盒(天根，北京)提取粪便菌群全基因组DNA，采用meta宏基因组二代高通量测序方法，分析粪便菌群组成(委托北京新科开源基因科技有限公司完成)。

1.5 数据整理与统计分析

应用SPSS17.0统计软件one-way ANOVA程序进行单因素方差分析，用LSD法进行多重比较，对饲用竹粉理化指标、IVDMD、生长性能、血清指标和粪便菌落数进行统计，以P<0.05表示差异显著，0.05≤P<0.10表示有差异趋势。

对于高通量测序数据，采用NGSTookit软件对所测序列进行质控和过滤(参数默认)，得到干净的读长(reads)片段。采用NCBI公布的真核、细菌(含古菌)、真菌和病毒参考基因组数据库(更新到2020年4月)，使用kraken软件，将各样本reads使用上述数据库采用最近公共祖先算法(LCA)进行物种注释(e value <1e-5)，得到各样本的细菌注释信息。剔除未知和真核等其他非研究目的序列之后，再做门到属水平物种含量统计。

采用metaSpades和megahit软件对序列进行组装，删掉长度<500 bp的短片段，得到拼接后的结果，使用Prokka软件进行基因预测，使用cd-hit软件在90%水平进行聚类，挑取最长序列作为代表序列，得到非重复序列基因(Unigene)序列集合，删掉Unigene中<100 bp的短片段。使用Diamond软件将Unigene代表序列和NCBI的NR数据库进行blastx比对(e value<1e-5)，得到物种注释信息，同时使用CARD耐药数据库，进行了blastn比对，得到样本中含有的耐药基因，挑取含量前10名的耐药基因。

为了更好地显示样本中物种丰度差别，将Unigene总表格进行了物种alpha多样性统计,利用各基因表达量计算各样本的alpha多样性。该步主要使用mothur软件完成。

2 结果与分析

2.1 不同饲用竹粉的理化指标

不同饲用竹粉的粒径和理化指标如表2所示。常规竹粉经超微粉碎处理后粒径分布发生较大变化，与常规竹粉相比，超微竹粉粒径分布的D75、D90和D98值分别降低72.14%、28.93%和25.99%。超微加工有降低饲用竹粉粗灰分含量的趋势(P=0.098)，对饲用竹粉水分、粗蛋白质、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量无显著影响(P>0.05)，但在数值上均有所降低。

表2 不同饲用竹粉的理化指标Table 2 Physicochemical indexes of different feeding bamboo powder %

2.2 不同饲用竹粉的IVDMD及其对断奶仔猪料IVDMD的影响

对不同饲用竹粉进行体外仿生消化处理48 h测定IVDMD，结果如图1和表3所示。超微竹粉的IVDMD显著高于常规竹粉(P<0.05)，增加了1.17%，增幅达到14.06%。

表3 不同饲用竹粉的体外干物质消化率Table 3 IVDMD of different feeding bamboo powder %

不同水平和不同来源饲用竹粉对断奶仔猪料IVDMD的影响见图2和表4。与对照组相比，添加2%常规竹粉或超微竹粉均显著降低断奶仔猪料的IVDMD(P<0.05)，而添加1%常规竹粉或超微竹粉对断奶仔猪料的IVDMD均无显著影响(P>0.05)。常规竹粉和超微竹粉添加水平对断奶仔猪料的IVDMD均有显著影响(P<0.05)，相同添加比例时超微竹粉组和常规竹粉组断奶仔猪料的IVDMD无显著差异(P>0.05)。

表4 不同饲用竹粉对断奶仔猪料体外干物质消化率的影响Table 4 Effects of different feeding bamboo powder on IVDMD of weaned piglets’ diet

图2 不同饲用竹粉对断奶仔猪料IVDMD的影响Fig.2 Effects of different feeding bamboo powder on IVDMD of weaned piglets’ diet

2.3 不同饲用竹粉对断奶仔猪生长性能的影响

不同饲用竹粉对断奶仔猪生长性能的影响如表5所示。超微竹粉组仔猪的平均日增重显著高于对照组(P<0.05)，料重比显著低于对照组(P<0.05)，平均日采食量与对照组相比无显著差异(P>0.05)。常规竹粉组仔猪的平均日增重、平均日采食量、料重比与对照组相比均无显著差异(P>0.05)。超微竹粉组仔猪的料重比显著低于常规竹粉组(P<0.05)，平均日采食量、料重比与常规竹粉组相比均无显著差异(P>0.05)。

表5 不同饲用竹粉对断奶仔猪生长性能的影响Table 5 Effects of different feeding bamboo powder on growth performance of weaned piglets

2.4 不同饲用竹粉对断奶仔猪血清生化指标的影响

不同饲用竹粉对断奶仔猪血清生化指标的影响如表6所示。超微竹粉组仔猪的血清甘油三酯含量显著高于常规竹粉组(P<0.05)，有高于对照组的趋势(0.05≤P<0.10)；常规竹粉组的血清甘油三酯含量与对照组相比无显著差异(P>0.05)。超微竹粉组仔猪的血清葡萄糖含量显著高于常规竹粉组(P<0.05)，有高于对照组的趋势(0.05≤P<0.10)；常规竹粉组与对照组相比无显著差异(P>0.05)。饲粮中添加常规竹粉和超微竹粉对断奶仔猪的血清胆固醇和尿素氮含量无显著影响(P>0.05)。

表6 不同饲用竹粉对断奶仔猪血清生化指标的影响Table 6 Effects of different feeding bamboo powder on serum biochemical indexes of weaned piglets mmol/L

2.5 不同饲用竹粉对断奶仔猪粪便菌群数量的影响

不同饲用竹粉对断奶仔猪粪便菌群数量的影响如图3和表7所示。超微竹粉和常规竹粉组仔猪的粪便大肠杆菌数量均显著低于对照组(P<0.05)，超微竹粉和常规竹粉组间无显著差异(P>0.05)。常规竹粉组仔猪的粪便乳酸杆菌数和总需氧菌数均显著低于对照组和超微竹粉组(P<0.05)，而超微竹粉和对照组间无显著差异(P>0.05)。超微竹粉组仔猪的粪便乳酸杆菌/大肠杆菌显著有高于对照组的趋势(0.05≤P<0.10)，与常规竹粉组无显著差异(P>0.05)。

表7 不同饲用竹粉对断奶仔猪粪便菌群数量的影响Table 7 Effects of different feeding bamboo powder on fecal flora number of weaned piglets

图3 不同饲用竹粉对断奶仔猪粪便菌群数量的影响Fig.3 Effects of different feeding bamboo powder on fecal flora number of weaned piglets

2.6 不同饲用竹粉对断奶仔猪粪便菌群组成和多样性的影响

不同饲用竹粉对断奶仔猪粪便菌群门类和属类占比的影响分别如图4和图5所示(本试验有关二代测序数据及项目描述，可参见NCBI项目号：PRJNA735410)。由图4可知，饲粮中添加1%饲用竹粉对断奶仔猪粪便菌群结构存在较大影响，与对照组相比，1%超微竹粉组广古菌门的相对丰度增加而放线菌门的相对丰度降低，1%常规竹粉组放线菌门的相对丰度增加而厚壁菌门的相对丰度降低。由图5可知，与对照组相比，1%超微竹粉组甲烷短杆菌属的相对丰度增加而梭菌属的相对丰度降低，1%常规竹粉组奥尔森姓菌属的相对丰度增加而乳酸菌属的相对丰度降低。

图4 不同饲用竹粉对断奶仔猪粪便菌群组成的影响(门水平)Fig.4 Effects of different feeding bamboo powder on composition of fecal flora of weaned piglets (at phylum level)

图5 不同饲用竹粉对断奶仔猪粪便菌群组成的影响(属水平)Fig.5 Effects of different feeding bamboo powder on composition of fecal flora of weaned piglets (at genus level)

从100万条序列/样本～500万条序列/样本，进行随机抽样，分别计算其alpha多样性指数。由图6可知，3组中仔猪粪便菌群chaos1指数和shannon指数均以常规竹粉组最高，超微竹粉组和对照组相对较低。

图6 不同饲用竹粉对断奶仔猪粪便菌群alpha多样性的影响Fig.6 Effects of different feeding bamboo powder on fecal flora alpha diversity of weaned piglets

2.7 饲用竹粉对断奶仔猪粪便菌群耐药基因的影响

使用CARD常用的耐药数据库，进行了blastn比对，得到样本中含有耐药基因，共发现412个Unigene基因为耐药抗性，共有125个耐药基因，挑取含量前10名的耐药基因绘图，如图7所示，对照组耐药基因相对丰度最高，超微竹粉组次之，常规竹粉组最低。

图7 不同饲用竹粉对断奶仔猪粪便菌群耐药基因表达的影响Fig.7 Effects of different feeding bamboo powder on fecal flora drug-resistant genes expression of weaned piglets

3 讨论

超微加工可以改变米糠不可溶纤维的粒径分布及其功能特性，超细米糠不可溶纤维具有较高的持水能力和溶胀能力，较高的酚提取率和抗氧化性能[25]。本试验也发现，经过超微加工改变了竹粉的粒径分布，颗粒D75、D90和D98分别降低72.14%、28.93%和25.99%，超微竹粉的IVDMD显著高于常规竹粉。与此相似的是，小麦仿生消化试验发现，随着粒径的降低，小麦的干物质和粗蛋白质体外消化率线性增加[26]；但在仔猪消化试验发现饲粮中添加不同粒径小麦对干物质和总能表观消化率无显著影响，随着小麦粒径的降低粗蛋白质消化率先增加后降低。生长猪T-型瘘管试验评估不同细度不同来源不可溶纤维原料的养分利用率，结果发现粗粉显著降低总能、干物质、总纤维、不可溶纤维表观回肠消化率，颗粒细度和纤维来源的交互作用显著影响后肠纤维消化率[24]。另一研究发现，随着苜蓿草添加水平的增加，仔猪部分氨基酸的表观回肠消化率和标准回肠消化率显著降低[27]。上述研究报道表明，粒径影响原料消化率，同时也受纤维来源、其他原料组分和添加水平的影响。这与本试验的结果相似，断奶仔猪饲粮中添加饲用竹粉的IVDMD受添加水平和原料加工程度的影响，且添加水平差异效果更明显，因此后续动物试验设置了1%添加水平以评估两种饲用竹粉的调控效果差异。

本试验发现，断奶仔猪饲粮中添加膳食纤维可改善生长性能，添加1%超微竹粉显著提高断奶仔猪的平均日增重，这与Chen等[1]在断奶后前2周添加1%纤维原料的结果相一致，添加不溶性纤维显著降低仔猪的料重比和腹泻率，显著提高干物质、粗蛋白质和有机质全肠道表观消化率，这说明不溶性纤维可能比可溶性纤维(SDF)更利于提高养分消化率。在肉鸡饲粮中添加适量不溶性纤维原料可增加肌胃重，降低肌胃pH，提高养分消化率，燕麦壳改善效果优于稻壳和向日葵壳[28]。上述试验表明，幼龄动物饲粮中添加适量不溶性纤维原料有利于改善消化和生长，饲用竹粉是富含中性洗涤纤维的不溶性纤维原料，超微化处理后可能更利于断奶仔猪营养代谢和生长，本试验还发现超微竹粉组仔猪的血清甘油三酯和葡萄糖含量显著高于常规竹粉组。

饲粮纤维可调控肠道菌群结构，研究发现提高妊娠母猪饲粮纤维水平可显著增加粪便微生物丰富度(Chao1指数)和多样性(Shannon指数)，增加纤维素降解菌(纤维杆菌属)和益生菌(瘤胃球菌属、丁酸弧菌属、乳杆菌属)比例，减少条件性致病菌(梭菌属、链球菌属、拟杆菌属和大肠杆菌-志贺菌属)数量[29]。Mu等[3]发现，苜蓿饲粮可增加仔猪肠道菌群的多样性，增加产琥珀酸的拟杆菌属的数量，调节大肠中丁酸产生菌的数量和活性，减少盲肠拟门杆菌的数量。Wang等[30]发现，生长猪饲粮中添加15%苜蓿草粉，增加了盲肠中毛螺菌属、脱硫弧菌属等的相对丰度，显著增加了盲肠丁酸产生菌的数量，导致丁酸浓度大幅度增加，盲肠黏膜中与短链脂肪酸吸收相关基因[游离脂肪酸受体3(FFAR3)、钠依赖性单羧酸转运蛋白1(SMCT1)和单羧酸转运蛋白1(MCT1)等]的mRNA表达水平增加。仔猪断奶时肠道微生态系统发生改变以适应新的环境，研究发现断奶仔猪饲粮中添加少量纤维有增加粪便挥发性脂肪酸含量的趋势，置于卫生条件较差的环境下粪便中乳酸菌和总挥发性脂肪酸含量显著增加[3]。本试验也发现，断奶仔猪饲粮中添加1%饲用竹粉显著降低粪便大肠杆菌数量，超微竹粉组乳酸杆菌/大肠杆菌有增加趋势。这表明断奶后2周通过添加少量饲用竹粉改善粪便菌群以期改善肠道健康和生长性能可能是可行的。

纤维原料类型和结构对断奶仔猪肠道菌群的调控效果存在影响。在仔猪断奶后前14 d添加菊粉来源的可溶性纤维或木质纤维来源的不溶性纤维，结果发现不溶性纤维组和不溶性纤维与可溶性纤维组合组仔猪的回肠乳酸菌含量显著增加，不溶性纤维调控效果似乎比可溶性纤维更明显[1]。PaBlack等[31]发现菊粉的微生物降解与其链长有关，长链菊粉对断奶仔猪食糜微生物发酵的影响比短链菊粉更明显，长链菊粉组的回肠食糜肠球菌、双歧杆菌、黏膜乳杆菌数量高于短链菊粉组。超微加工可以改变纤维特性，研究发现超微加工米糠不溶性纤维改变了纤维粒径分布，增加了纤维吸水膨胀性、抗氧化性和酚类提取效率[25]。本试验发现，超微粉加工改变了饲用竹粉的粒径分布，其在粪便菌群调控方面也存在差异，通过宏基因组学测定分析发现，超微竹粉组仔猪的粪便甲烷短杆菌属的相对丰度增加而梭菌属降低，常规竹粉组欧式菌属的相对丰度增加而乳酸菌属降低，这表明超微竹粉更利于增加纤维降解菌而降低条件性致病菌，可能更适合作为断奶仔猪纤维原料来源用于调控仔猪肠道菌群平衡。