反刍动物包被缓释尿素饲料的研究进展

田锦秀 郑 楠 王加启 赵圣国*

(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京 100193；2.青岛农业大学动物科技学院(草业学院)，青岛 266109)

随着反刍动物养殖业的迅猛发展，牛、羊等反刍动物对蛋白质饲料的需求愈加旺盛，饲料资源短缺问题逐渐显露。我国是世界上最大的大豆消费国，2020年我国大豆进口量达到创纪录的1.003 3亿t，进口依存度高达87%，已成为我国养殖业“卡脖子”问题，严重制约我国反刍动物养殖业的健康发展[1]。因此，迫切需要寻找可以替代豆粕的蛋白质饲料。《饲料添加剂品种目录(2013)》(农业农村部公告第2045号)文件中指出，可以在反刍动物饲料中添加的非蛋白氮有10种，分别为尿素、碳酸氢铵、硫酸铵、液氨、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、异丁叉二脲、磷酸脲、氯化铵、氨水，其中尿素是最常用的一种非蛋白氮。《饲料添加剂安全使用规范》(农业农村部第2625号)文件中明确，在配合饲料或全混合日粮中尿素的最高限量为1%(以干物质含量88%为基础计算)。欧洲食品安全局(European Food Safety Authority)2012年研究报告表明，饲料中添加1%尿素(干物质基础)对动物而言是安全的，不会增加环境氮负荷，也不会对消费者的安全产生任何影响[2]。尿素除了具有替代豆粕节约饲粮成本的作用之外，更重要的是尿素能促进纤维分解菌生长、补充瘤胃氨氮不足、提高瘤胃微生物蛋白(MCP)合成[3]、压缩饲粮配制空间用于提升能量原料含量，发挥重要的营养学功能。

尿素进入瘤胃后能迅速被瘤胃内脲酶水解为氨，继而合成瘤胃MCP被机体利用，MCP是小肠可代谢蛋白质的主要来源，占60%～85%。瘤胃内脲酶的活性过强时，尿素水解速度大于利用速度，会导致微生物合成MCP所需的氨与降解氨数量不匹配，造成瘤胃内氨的积累或者随尿排出而污染环境。包被缓释尿素是一种高效的非蛋白氮，饲喂后在瘤胃中能缓慢释放氨，从而降低瘤胃内氨的峰值浓度[4]，促进能氮同步释放，保证瘤胃微生物对氨的充分利用，从而减少氨的积累与浪费。Kottegoda等[5]试验证明，普通尿素氮在水中立即释放，而包被尿素氮释放缓慢。因此，为降低瘤胃内尿素水解速度，最大限度提高微生物对氨的利用率，开发尿素缓释技术尤为重要。尿素舔砖、膨润土尿素、糊化淀粉尿素[6]等传统缓释尿素的缓释效果不佳导致其在实际生产中应用受影响。通过化学反应制备尿素的化学衍生物用于尿素缓释，如磷酸脲、双缩脲、羟甲基尿素等[7]，其价格高，缓释效果也不理想，甚至有的(比如双缩脲)被禁止添加到饲料中。

1 尿素包被技术

包被缓释尿素是以尿素作为饲料芯，用一层或多层特殊的包被材料包裹尿素而成。图1为未包被和包被尿素的释放模式以及双层包被的缓释尿素模型。常用的缓释包被材料主要包括天然合成或人工合成的聚合物、生物复合材料(改性后的淀粉)以及黏土矿物的纳米复合材料等，根据其释放模型可分为包膜型缓释和骨架型缓释。

图1 包被和未包被尿素样品的氮释放模式(a)和双层包被缓释尿素模型(b)Fig.1 Nitrogen release patterns of coated and uncoated urea samples (a) and double coated slow-release urea model (b)[11]

1.1 包膜型缓释尿素

包膜型缓释尿素外层一般为疏水性或低亲水性的单层(或多层)的包衣材料，核芯为尿素。包膜材料一般为天然聚合物如淀粉、纤维素等。图2为聚合物包被尿素的控释扩散机理[12]，水渗透进包衣层溶解尿素，随后溶解的尿素通过包衣层向外扩散。在制作时也可向水不溶性包膜材料中加入致孔剂，尿素通过小孔向外释放。Zhang等[11]使用乙基纤维素为内包衣，改性淀粉为外包衣制作双层包被尿素，改性淀粉作为第1道屏障，乙基纤维素作为第2道屏障，水分子首先通过改性淀粉渗透到层间空间，随后，渗透的水分子进入内部疏水层乙基纤维素中，最终溶解内部尿素芯，溶解的尿素透过双层屏障得以释放。

a：带有聚合物涂层的尿素芯；b：水渗透到涂层和芯颗粒中；c：溶解和渗透压升高；d：通过溶胀的涂层膜控制尿素释放。a: urea core with polymer coating; b: water penetrates into the coating and core granule; c: fertilizer dissolution and osmotic pressure development; d: controlled release of urea through swollen coating membrane.图2 控释扩散机理Fig.2 Mechanism of slowed-release diffusion of polymer coated urea[12]

1.2 骨架型缓释尿素

骨架型缓释尿素是将尿素包裹在特殊骨架材料中，或者是通过不同物质分子间化学交联形成具有网络结构的高分子聚合物，尿素通过骨架或者网络中弯曲孔道得以溶解释放。可作为骨架的材料较多，包括溶蚀性骨架材料如氢化植物油、蜂蜡、巴西棕榈蜡等，亲水性凝胶骨架材料如甲基纤维素、海藻酸盐等，不溶性骨架材料如乙基纤维素，目前在生产中以氢化植物油使用最为普遍[13]。De Medeiros等[14]和Carvalho等[10]分别用巴西棕榈蜡和蜂蜡对尿素进行包封，所得骨架型缓释尿素的包封率高并且有较好的尿素缓释性能。通过不同分子间的交联形成高聚物也能达到缓释效果，例如，Sarkar等[15]采用聚乙二醇(PEG)和硫酸钠为交联剂，合成了生物相容性好、无毒、环境友好的聚乙烯醇(PVA)基高分子水凝胶，再加入尿素进行改性，所制成的凝胶基质同时具有缓释尿素和高吸附Fe3+的潜力。

1.3 综合型缓释尿素

除单纯的包膜型和骨架型缓释尿素外，也可将二者相互结合，以包衣膜为外层，将骨架型结合尿素包裹在膜内制成综合型缓释尿素。水分子依次通过包膜层、骨架进入内部溶解尿素，释放时先通过骨架材料的内部孔道渗透到层间，再通过疏水性或低亲水性包膜材料最终释出。综合型缓释尿素的释放速率会比单层更加缓慢，当一种包被方式的释放速率难以达到某些要求时，综合型缓释尿素不失为一种更好的选择。

2 天然聚合物包被材料

表1 天然聚合物包被的缓释尿素Table 1 Slow-release urea coated with natural polymer

续表1缓释包被材料Slow-release coating material作用效果Effect文献Literature内层卡拉胶+海藻酸钠,外层卡拉胶、聚丙烯、硅藻土共聚物κ-carrageenan-sodium alginate and cross-linked κC-g-poly (acrylic acid)/celite superabsorbent 土壤中25 d释放94.2%Wang等[25]环氧大豆油多元醇低聚物Epoxy soybean oil polyol oligomer水中7 d溶出率53.68%～64.76%张宇东等[26]

3 尿素缓释效果的体外评价技术

制成的包膜型、骨架型缓释尿素产品需要从体外对其一系列性能进行评价，才能为进一步的动物试验提供可靠依据。评价指标包括包被产率和效率，孔隙度、交联密度和吸水率，微观结构，热稳定性，化学结构的改变，尿素释放模式及其与能量释放的同步性等。

3.1 包被产率和效率

通过对包被产率和效率进行计算，可以评估包衣物质是否适合做尿素的涂层材料。

包被产率取决于制备时加入的包衣材料、交联剂、尿素等物质的干重和最终产物的干重。

MY(%)=(Wfinal/Winitial)×100[10]。

式中：MY为包被产率；Wfinal为包被产品的干重;Winitial为制备时加入的包衣材料、交联剂、尿素的干重。

包被效率可评价包衣材料的尿素保留能力，根据制备时尿素的加入量和加工后尿素的剩余量计算，公式如下：

ME(%)=(Ureal/Utheoretical)×100[10]。

式中：ME为包被效率；Ureal为存留尿素的实际含量；Utheoretical为插入的尿素含量。

3.2 孔隙度、交联密度和吸水率

表征缓释尿素的性能需要对其孔隙度、交联密度和吸水率进行测定。孔隙度越小，交联密度越高，尿素释放时间就越长，二者呈负相关。而交联密度越高，吸水性就越小，缓释时间也会变长。孔隙度和吸水率按照如下公式计算：

ε(%)={[(Ww-Wd)/ρw]/[(Ww-Wd)/
ρw+Wd/ρp]}×100[27]。

式中：ε为孔隙度；Ww为包膜吸水后的湿重；Wd为包膜吸水前的干重；ρw为水的密度；ρp为缓释包膜的密度。

吸水率(%)=[(W2-W1)/W1]×100[27]。

式中：W1为包膜未吸水前的干重；W2为包膜吸水后的重量。

交联密度采用核磁共振交联密度分析仪检测。

3.3 微观结构

常用扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)观察包被缓释尿素的微观结构。SEM是一种用于高分辨率微区形貌分析的大型精密仪器。TEM可以看到小于0.2 μm的亚显微结构或超微结构。通过SEM与TEM的图像可以看到包膜涂层的数量、厚度等参数随喷涂时间或其他工艺改变的变化情况，从而进一步为分析尿素缓释机制提供依据。Kottegoda等[5]制作出一种以羟基磷灰石为骨架的缓释尿素产品，SEM和TEM图像显示为一个纳米尺度的晶体结构。Zhang等[11]对淀粉和酯化后的淀粉进行了SEM分析，图像中可以看到未酯化的天然淀粉颗粒饱满，呈椭圆形或圆形，表面光滑没有空隙，而酯化后的淀粉颗粒不规则，表面有凹痕裂纹，证明酯化反应对淀粉的晶体结构产生了一定的影响。图3为包膜缓释尿素放大25倍的SEM显微照片。

图3 包膜缓释尿素放大25倍的SEM显微照片Fig.3 SEM micrograph of coated slow release urea at 25 times magnification[28]

3.4 热稳定性

热重分析(TG)是在程序控制温度下，测量物质的质量与温度或时间的关系。差示扫描量热法(DSC)是在程序升温的条件下，测量试样与参比物之间的能量差随温度变化的一种分析方法。这2种方法都是热分析方法，可以用来检测缓释尿素产品的热稳定性。Rahim等[21]采用壳聚糖与天然橡胶等制作了一种生物复合材料用于尿素缓释，用TG分别对壳聚糖、天然橡胶和生物复合材料进行比较，图像显示壳聚糖为两步降解，而天然橡胶和生物复合材料均为单降解且降解温度较高(图4)，说明做成生物复合材料克服了壳聚糖溶解性低的缺点，从而提高了其作为缓释尿素载体材料的热稳定性。De Medeiros等[14]采用DSC分析了巴西棕榈蜡、尿素及其按照不同比例制成的缓释尿素产品的热稳定性，所有物质只显示出熔融的吸热行为，棕榈蜡的熔点为83.9 ℃，尿素的熔点为135.83℃，与分离的尿素相比，缓释尿素产品中的尿素熔融温度略有升高，这表明即使在熔融的情况下，巴西棕榈蜡也能够保护尿素，具有较好的热稳定性。

图4 TG曲线(a)[21]与DSC曲线(b)Fig.4 TG curve (a)[21] and DSC curve (b)[14]

3.5 化学结构的改变

傅里叶红外光谱(FTIR)能对样品进行定性定量的微观分析，可以从图像波数、强度等信息中推导出缓释材料中化学键基团的改变。Shi等[29]采用FTIR对所制成的颗粒状生物炭-矿物尿素复合材料(Bio-MUC)进行微观分析，结果显示，与母体生物炭(BC)相比，Bio-MUC光谱在较高和较低波数下均显示出强度增加，Bio-MUC的N—H和/或O—H相关峰的强度更大(约3 500 cm-1)，尤其是在3 620 cm-1的峰伴随着膨润土和海泡石Al-OH和Mg-OH拉伸振动(图5)，表明尿素和生物炭之间发生了反应。在Dubey等[30]的FTIR分析中，以丙烯酸树脂为黏结剂的沸石包膜尿素(UZ-AP)显示出与丙烯酸聚合物和尿素相似的峰形，说明UZ-AP具有类似于尿素和沸石的表面功能。

图5 Bio-MUC与BC的FTIRFig.5 FTIR of Bio-MUC and BC[29]

3.6 尿素释放模式及其与能量释放的同步性

制作缓、控释产品，其相对生物利用度应当是普通常释制剂的80%～120%，稳态时的峰谷浓度之比(Cmax/Cmin)要低于普通制剂，并且整个缓释时间不能比再次给予缓释产品的间隔时间低，累计释放率要高于90%以上[13]。不同包被材料的物理化学性质不同，其尿素的释放机制也会有所差别[31]。用零级动力学、一级动力学、Higuchi和Korsmeyer-Peppas等动力学模型拟合尿素释放的动力学，得到速率常数和R2，用于研究和识别尿素的释放机制。Silva[32]的拟合试验结果表明，2种不同方法制作的纳米杂化材料(SOD和SMW)释放行为均符合Korsmeyer-Peppas模型，R2分别为0.99和0.99(图6)，这表明尿素的释放受到其通过二氧化硅纳米颗粒基质的扩散速率控制。同样，Kottegoda等[5]用线性拟合方式对尿素和尿素与羟基磷灰石纳米杂化物(U-HA)的释放动力学进行分析，根据R2，Higuchi模型最为合适，因此U-HA的释放机制是尿素通过扩散从均匀骨架中释放。评价缓释产品的释放首先应从释放速率上评价，可以制作释放率-时间曲线，引入合理的释放“区间”，取3个时间点用于评价缓释产品的释放速率，让3个时间点的释放率分别满足25%～45%、50%～70%、70%～90%，以此作为缓释效果的参考指标，评价所制备缓释尿素的可适用性[13]。另外，还可以从能氮同步的角度出发，由于瘤胃微生物的生长依赖于能量供应，维持瘤胃中氨的产生速度与碳水化合物的消化速度相协调非常重要。因此，需要从体外找到一个最佳的尿素释放速率。可以分别向瘤胃液中加入预先设定不同释放速率的尿素，例如，以1～10 mL/min递加的速度释放，5 mL/min恒定的速率度释放，以及以10～1 mL/min递减的速度释放，或者前几小时递加后几小时递减等多种不同的释放速率，释放12 h。取释放0、2、4、6、8、10、12 h的瘤胃液样品，检测不同释放速率对瘤胃发酵和MCP合成的影响。通过这种方法，可以找到能促进瘤胃发酵以及MCP合成的最大尿素释放速率，作为缓释效果评价的参考指标。

图6 比较尿素(A)、SOD(B)和SMW(C)的释放行为(Ⅰ)以及SOD(Ⅱ)和SMW(Ⅲ)的Korsmeyer-Peppas模型的释放动力学Fig.6 Comparison of release behavior of urea (A), SOD (B) and SMW (C) (Ⅰ) and release kinetics for Korsmeyer-Peppas model of SOD (Ⅱ) and SMW (Ⅲ)[32]

4 尿素缓释效果的动物试验评价

动物试验是评价缓释尿素产品作用效果最重要的部分。一般评价缓释尿素产品在反刍动物养分消化率、瘤胃发酵、泌乳性能，生长性能等方面的影响。

4.1 对反刍动物养分消化率的影响

4.2 对反刍动物瘤胃发酵的影响

牛、羊等反刍动物与单胃动物相比，最大的区别就是反刍动物的瘤胃中栖息着大量的微生物，这些微生物一方面可以帮助反刍动物降解摄入的纤维性碳水化合物，生成能量物质，如挥发性脂肪酸(VFA)；另一方面可以将摄取的营养物质转化为MCP，被宿主动物吸收利用。开发缓释尿素产品就是为了降低瘤胃内氨态氮(NH3-N)的释放速率，保持瘤胃微生物利用与NH3-N释放的同步性，改善瘤胃发酵，促进更多MCP的合成。Cherdthong等[19]采用体外培养技术，研究了不同尿素产品[尿素和尿素钙混合物(UCM)]在不同能源(木薯片或玉米粉)条件下对瘤胃发酵的影响，在整个体外试验中，使用尿素产生的NH3-N浓度最高，尿素钙混合物与木薯片配合使用显著降低瘤胃NH3-N浓度，其原因可能是尿素钙混合物与尿素相比，NH3-N的释放速率较慢，这与Gardinal等[33]的试验结果一致。在Chegeni等[20]的试验中，使用聚合物包膜尿素(PCU)能使瘤胃中的NH3-N浓度持续升高，饲喂后3 h达到最高水平，并持续到饲喂后7 h。在瘤胃发酵过程中，缓慢释放尿素的饲粮可以延长微生物对额外氮源的利用。Cherdthong等[34]试验证明，在高水平木薯片精料中添加U-Cal或U-Cas，除丙酸外，VFA的浓度和VFA的摩尔比均无显著差异，肉牛瘤胃中的VFA总量不受缓释尿素的影响，丙酸浓度的提高可能与该组较高的精料采食量有关，说明U-Cal或U-Cas不会对瘤胃发酵产生不利影响。

4.3 对反刍动物泌乳性能的影响

使用缓释尿素能降低NH3-N的释放速率，促进MCP合成，进而提高转化为牛奶的效率。Highstreet等[18]的研究中，在高可溶性粗蛋白质饲粮中使用缓释尿素Nitroshure替代尿素，结果表明，饲喂缓释尿素Nitroshure可以增加泌乳早期高产奶牛乳中乳蛋白、能量、乳脂的含量，而饲喂等氮基础的尿素对泌乳早期高产奶牛乳中乳蛋白、能量、乳脂的含量影响不大。与尿素相比，缓释尿素的释放速率较慢，这可能降低了瘤胃氨的峰值浓度，足以影响瘤胃中产生的VFA的分布，从而对乳脂合成等产生积极影响。Xin等[35]分别比较了饲喂饲料级尿素、聚氨酯包衣尿素和豆粕饲粮对奶牛泌乳性能的影响，与饲喂饲料级尿素饲粮相比，饲喂聚氨酯包衣尿素饲粮的奶牛乳中乳蛋白含量和产奶量较高，但与豆粕饲粮差异不大，因此，聚氨酯包被尿素可以在饲粮中部分替代豆粕[36]。此外，有试验表明，通过使用玉米青贮或玉米粒中的干物质填充缓释尿素创造的饲粮配方空间，也可能改善了瘤胃的可发酵碳水化合物和能量状态，从而提高乳中乳蛋白和乳脂的含量[17]。

4.4 对反刍动物生长性能的影响

5 存在的问题与展望

尽管近几年缓释包被尿素技术的研究越来越多，但仍有一些问题没有解决。首先，包被材料过于单一，大多数以氢化植物油为基础，未来需要挖掘价廉易得、安全性高、缓释效果好的包被材料；其次，缓释包被尿素产品的评价体系和标准仍为空白，尤其缺乏与瘤胃发酵、能氮同步、MCP合成等联系起来的综合评价技术。另外，缓释包被尿素产品的效果还不稳定，有的缓释效果好，有的并没有缓释效果，主要是对瘤胃微生物脲酶分解尿素的机制尚不明确，因此，筛选适当的天然安全缓释材料、建立缓释尿素评价标准、揭示脲酶分解尿素机制，是未来缓释尿素研究的重要内容，将有助于新型缓释尿素产品的开发，提高尿素利用率，支撑反刍动物健康养殖。