绝经后骨质疏松症患者血清miR-21和Smad7表达变化及其临床意义

何至，颜端国，严林

1 监利市人民医院骨一科，湖北监利433300；2 华中科技大学同济医学院附属荆州医院骨一科

绝经后骨质疏松症(PMOP)是发生于绝经后妇女的一种常见代谢性疾病，由于雌激素缺乏导致骨量减少和骨组织结构变化，骨脆性增加而易于发生骨折，是中老年妇女生活质量降低以及致残或致死的重要原因[1]。研究证实，表观遗传学参与PMOP的发生、发展。微小RNA(miRNA)是一类长度为20～25个核苷酸的内源性非编码小分子RNA。有研究报道，部分miRNA能够通过调控破骨细胞和成骨细胞分化，参与PMOP的发生、发展[2]。miR-21是miRNA家族成员之一，定位于人染色体17q23.2。PERKSANUSAK等[3]研究发现，PMOP患者血清miR-21表达明显降低，提示miR-21能够参与PMOP的发生、发展。Smad同源物7(Smad7)是在成骨分化和骨形成过程中起重要作用的TGF-β信号通路的内源性负反馈调节因子。Smad7能够抑制成骨细胞增殖和分化，从而影响骨形成和骨分化[4]。LI等[5]研究发现，miR-21能够通过调节Smad7促进成骨细胞增殖、分化和矿化。邓纯博等[6]研究报道，在通过双侧卵巢切除去势建立的骨质疏松症(OP)小鼠模型骨组织中miR-21表达明显降低，而Smad7表达明显升高，提示miR-21、Smad7可能参与PMOP的发生、发展。但目前PMOP患者血清miR-21、Smad7表达变化及其与骨密度和骨代谢关系的研究相对较少。本研究探讨了PMOP患者血清miR-21、Smad7表达变化及其临床意义。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017年1月—2020年1月监利市人民医院收治的PMOP患者40例(骨质疏松组)。纳入标准：①符合《原发性骨质疏松症诊治指南》中关于PMOP的诊断标准[7]；②初诊，入院前未接受任何抗骨质疏松治疗；③年龄50～75岁；④绝经1年以上。排除标准：①合并自身免疫功能异常者；②存在肝肾功能不全者；③合并甲状腺或甲状旁腺疾病、糖尿病、垂体疾病等影响骨代谢疾病者；④合并心脑血管疾病者；⑤临床资料不完整者。同期另选在监利市人民医院就诊的，与骨质疏松组临床资料相匹配的绝经后骨密度降低(-2.5 SD≤骨密度<-1.0 SD)患者40例(骨密度降低组)和绝经后骨密度正常(-1.0 SD≤骨密度≤1.0 SD)健康志愿者40例(骨密度正常组)。其中，骨质疏松组年龄(61.4±4.8)岁，BMI(21.56±4.68)kg/m2，有吸烟史21例，合并高血压6例、高脂血症4例；骨密度降低组年龄(60.3±5.2)岁，BMI(21.78±4.57)kg/m2，有吸烟史19例，合并高血压5例、高脂血症3例；骨密度正常组年龄(59.7±4.5)岁，BMI(23.17±4.43)kg/m2，有吸烟史22例，合并高血压4例、高脂血症5例。三组年龄、BMI、吸烟史、合并症等具有可比性。本研究经监利市人民医院医学伦理委员会批准(审批编号：20170106)，所有研究对象或其家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 血清miR-21、Smad7 mRNA表达检测 采集所有研究对象就诊当日清晨空腹肘静脉血5 mL，置于含EDTA的真空采血管中，4 ℃下3 000 r/min离心10 min(离心半径13.5 cm)，留取上层血清，-80 ℃冰箱保存。采用TRIzol法提取血清总RNA，经紫外可见分光光度计鉴定，提取的总RNA浓度和纯度合格。按PrimeScriptTMRT Reagent Kit说明，将总RNA逆转录为cDNA。逆转录条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。以cDNA为模板，按SYBR®Premix EX TaqTMⅡ说明进行PCR扩增。引物序列：miR-21上游引物5′-GCGGTAGCTTATCAGACTGA-3′、下游引物5′-TGCGTGTCGTGGAGTC-3′，内参U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；Smad7上游引物5′-TGTCCAGATGCTGTGCCTTCCT-3′、下游引物5′-CTCGTCTTCTCCTCCCAGTATG-3′，内参GAPDH上游引物5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′、下游引物5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。PCR反应体系共25 μL：cDNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，2×SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ 12.5 μL，dH2O 8.5 μL；反应条件：95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s共40个循环。PCR反应结束后绘制熔解曲线，收集循环阈值(CT)数。以U6或GAPDH为内参，采用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.3 血清β-胶原降解产物(β-CTX)、1型前胶原氨基端延长肽(P1NP)检测 采集所有研究对象就诊当日清晨空腹肘静脉血5 mL，置于含EDTA的真空采血管中，4 ℃下3 000 r/min离心10 min(离心半径13.5 cm)，留取上层血清，-80 ℃冰箱保存。采用ELISA法检测血清β-CTX、P1NP。试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，所有操作严格按照试剂盒说明进行。

1.4 骨密度检测 所有研究对象就诊当日由专业技术人员使用双能X射线骨密度仪检测股骨、腰椎骨密度。

2 结果

2.1 三组血清miR-21、Smad7 mRNA表达比较 见表1。

表1 三组血清miR-21、Smad7 mRNA相对表达量比较

2.2 三组血清β-CTX、P1NP水平和股骨、腰椎骨密度比较 见表2。

表2 三组血清β-CTX、P1NP水平和股骨、腰椎骨密度比较

2.3 PMOP患者血清miR-21、Smad7 mRNA表达与血清β-CTX、P1NP水平及股骨、腰椎骨密度的关系 Pearson相关分析显示，PMOP患者血清miR-21表达与血清β-CTX、P1NP水平均呈负相关关系(r分别为-0.667、-0.562，P均<0.05)，与股骨、腰椎骨密度均呈正相关关系(r分别为0.549、0.538，P均<0.05)；血清Smad7 mRNA表达与血清β-CTX、P1NP水平均呈正相关关系(r分别为0.710、0.535，P均<0.05)，与股骨、腰椎骨密度均呈负相关关系(r分别为-0.604、-0.555，P均<0.05)；PMOP患者血清miR-21表达与Smad7 mRNA表达呈负相关关系(r=-0.525，P<0.05)。

2.4 血清miR-21、Smad7 mRNA表达对PMOP的诊断效能分析 ROC曲线分析显示，血清miR-21表达诊断PMOP的曲线下面积(AUC)为0.945(95%CI：0.910～0.981)，其cut off值为0.585，此时其诊断PMOP的灵敏度为80.0%、特异度为95.0%；血清Smad7 mRNA表达诊断PMOP的AUC为0.927(95%CI：0.877～0.977)，其cut off值为1.905，此时其诊断PMOP的灵敏度为78.8%、特异度为92.3%；二者联合诊断PMOP的AUC为0.978(95%CI：0.950～1.000)，其诊断PMOP的灵敏度为99.8%、特异度为92.7%。

3 讨论

OP是一种以骨量降低、骨微结构破坏、骨质脆性增加和易于骨折为特征的全身代谢性骨病。绝经后妇女是OP的高发人群，其患病率超过50%，骨折率达到10%[8]。绝经后妇女卵巢功能衰退，体内雌激素水平下降，导致破骨细胞和成骨细胞的代谢失衡，骨吸收亢进，表现为骨密度下降，骨脆性增加，极易发生骨折[9-10]。随着人口老龄化加剧，PMOP越来越受到重视。骨代谢包括骨形成和骨吸收两个生化过程。随着对骨代谢研究的不断深入，骨形成标志物和骨吸收标志物已成为诊治代谢性骨病的特异性指标。β-CTX是细胞外基质中的胶原纤维降解产物，能够反映骨基质降解速率，而P1NP则能够反映Ⅰ型胶原合成速度和成骨细胞活性，二者均与骨代谢、骨密度密切相关。虽然近年来骨代谢标志物在诊断PMOP方面取得了一定进展，但因其易受其他因素干扰，特异度较低，在PMOP早期诊断中的价值不能令人满意[11]。

miRNA是一种广泛存在的调控基因表达的小分子RNA。有研究报道，部分miRNA能够通过调控破骨细胞和成骨细胞分化参与PMOP的发生、发展[2]。miR-21定位于人染色体17q23.2，在调节细胞生长、发育及代谢等方面具有重要作用[12-13]。有研究发现，miR-21与成骨细胞分化和矿化有关[5]。Smad7是TGF-β信号通路的内源性负反馈调节因子，能够参与调控细胞增殖、分化、凋亡等一系列生物学活动[14-16]。有研究报道，PMOP患者血清miR-21表达明显降低；在双侧卵巢切除去势建立的骨质疏松症小鼠模型骨组织中miR-21表达明显降低，而Smad7表达明显升高[3，6]。提示miR-21和Smad7可能是参与PMOP发生、发展的重要因子。β-CTX、P1NP是反映骨代谢的特异性标志物，二者水平升高往往意味着骨转换速率加快，即骨量丢失增加、骨密度降低[17]。

本研究结果发现，骨质疏松组血清miR-21表达明显低于骨密度降低组和骨密度正常组,血清Smad7 mRNA表达和血清β-CTX、P1NP水平均明显高于骨密度降低组和骨密度正常组；并且骨密度降低组血清miR-21表达明显低于骨密度正常组，血清Smad7 mRNA表达和血清β-CTX、P1NP水平均明显高于骨密度正常组。提示miR-21、Smad7可能参与PMOP的发生、发展过程。有研究报道，miR-21能够介导Smad7下调来促进成骨细胞分化[18]。本研究Pearson相关分析显示，PMOP患者血清miR-21表达与股骨、腰椎骨密度均呈正相关关系，与血清β-CTX、P1NP水平均呈负相关关系；血清Smad7 mRNA表达与股骨、腰椎骨密度均呈负相关关系，与血清β-CTX、P1NP水平均呈正相关关系；PMOP患者血清miR-21表达与Smad7 mRNA表达呈负相关关系。提示miR-21与Smad7可能共同参与PMOP的发生、发展。

本研究ROC曲线分析显示，血清miR-21、Smad7 mRNA表达对PMOP均具有一定诊断价值，二者联合时诊断价值更高。提示血清miR-21、Smad7可作为早期诊断PMOP的生物学标志物。

综上所述，PMOP患者血清miR-21表达降低、Smad7表达升高，二者可能共同参与PMOP的发生、发展；血清miR-21、Smad7表达对PMOP均具有较高的诊断价值，二者联合时诊断价值更高。