血清miR-21-3p、IL-18水平对重症急性胰腺炎患者急性肾损伤的预测价值

宋微，李虹怡，吕洪波

葫芦岛市中心医院消化内科，辽宁葫芦岛125000

重症急性胰腺炎(SAP)是临床常见的一种急腹症，起病急骤，发展迅猛，病情凶险，常并发休克或多器官功能衰竭等，病死率为15%～56%[1]。急性肾损伤(AKI)是指突发且持续性肾功能快速减退所致的临床综合征[2]。SAP发生时会产生大量炎症因子进入血液循环，极易造成AKI。据报道，在SAP患者中AKI的发生率为14%～43%，并且合并AKI的SAP患者病死率为71%～84%[3]。以往临床多采用血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)等指标来预测AKI的发生风险，但这些指标易受饮食、尿量等因素影响，同时存在诊断滞后性[4]。因此，探索新的早期诊断AKI的生物标志物具有重要意义。微小核糖核酸(miRNA)是一类内源性非编码小RNA分子，在细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程中具有重要的调控作用。miR-21-3p是miRNA家族成员之一，能够参与肾脏疾病的发生、发展。有研究报道，miR-21-3p、Scr、胱抑素C(Cys C)联合检测对脓毒症患儿AKI发生具有较高的预测价值[5]。IL-18是一种由激活的单核—巨噬细胞分泌的前炎症因子，主要发挥免疫诱导作用。有研究发现，体外循环术后AKI患者尿液IL-18水平明显升高，并且其水平能够在一定程度上反映肾损伤程度[6]。但血清miR-21-3p、IL-18水平能否早期预测SAP患者AKI发生尚不清楚。为此，本研究探讨了血清miR-21-3p、IL-18水平对SAP患者AKI发生的预测价值。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2018年1月—2021年6月葫芦岛市中心医院收治的SAP患者195例。SAP临床诊断参照《中国急性胰腺炎诊治指南(2013年，上海)》[7]。纳入标准：①符合SAP诊断标准；②发病至入院时间<72 h；③年龄18～75岁。排除标准：①SAP发病前已存在慢性肾衰竭、慢性肾炎等肾功能损伤者；②合并其他重要脏器功能障碍者；③合并急慢性炎症性疾病或自身免疫性疾病者；④入院后48 h内死亡者；⑤合并精神疾病或恶性肿瘤者；⑥妊娠期或哺乳期妇女。根据住院期间是否发生AKI[8]，将SAP患者分为AKI组57例和非AKI组138例。本研究经葫芦岛市中心医院医学伦理委员会批准(批准编号：20181021)，所有研究对象或其家属知情同意并签属书面知情同意书。

1.2 血清miR-21-3p检测 所有研究对象入院次日采集清晨空腹肘静脉血3 mL，置于不含抗凝剂的离心管中，3 000 r/min离心10 min、离心半径12 cm，留取上层血清，-80 ℃保存。采用TRIzol法提取血清总RNA，经NanoDrop Lite分光光度计鉴定，提取的总RNA浓度和纯度合格。按PrimeScipt RT Reagent Kit说明将总RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板，按SYBR®Green Realtime PCR Master Mix说明进行PCR扩增。引物序列由北京天根生化科技有限公司设计合成。引物序列：miR-21-3p上游引物5′-ACTCCTACGACTTAGACATG-3′、下游引物5′-GACTGTATGCTGTCGTAG-3′，扩增片段长度542 bp；内参U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，扩增片段长度386 bp。PCR反应体系共20 μL：TaqMan MicroRNA Assay 1 μL，cDNA模板1.3 μL，上下游引物各2.0 μL，TaqMan 2×Universal PCR Master Mix 10.0 μL，无酶双氧水3.7 μL；扩增条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s、60 ℃退火60 s共45个循环。PCR反应结束后绘制熔解曲线，收集循环阈值(CT)数。所有操作在ABI 7500型荧光定量PCR仪上完成。以U6为内参，采用2-ΔΔCT法计算miR-21-3p相对表达量。

1.3 血清IL-18检测 所有研究对象入院次日采集清晨空腹肘静脉血3 mL，置于含有抗凝剂的离心管中，3 000 r/min离心10 min、离心半径12 cm，留取上层血清，-80 ℃保存。采用ELISA法检测血清IL-18。IL-18 ELISA试剂盒购自美国eBioscience公司，检测仪器为Olympus AU2700全自动生化分析仪。所有操作严格按照试剂盒说明进行。

1.4 资料收集分析 所有研究对象入组后收集基本病历资料、实验室检查资料、Ranson评分[9]。其中，基本病历资料包括性别、年龄、BMI、糖尿病史、高血压史、收缩压、舒张压；实验室检查资料包括空腹血糖(FPG)、TG、TC、HDL-C、LDL-C、Scr、BUN、高敏C反应蛋白(hs-CRP)、Cys C。采用Logistic回归模型分析SAP患者AKI发生的危险因素。

2 结果

2.1 两组血清miR-21-3p、IL-18水平比较 AKI组与非AKI组血清miR-21-3p相对表达量分别为2.45±0.67、0.98±0.55，血清IL-18水平分别为(187.46±39.21)、(72.50±33.18)pg/mL。AKI组血清miR-21-3p、IL-18水平均高于非AKI组(t分别为15.904、20.846，P均<0.05)。

2.2 SAP患者AKI发生的危险因素分析 两组基本病历资料和实验室检查资料比较见表1、2。AKI组与非AKI组Ranson评分分别为(4.02±0.39)、(1.50±0.35)分，AKI组Ranson评分高于非AKI组(t=44.218，P<0.05)。

表1 两组基本病历资料比较

表2 两组实验室检查资料比较

以SAP患者是否发生AKI为因变量(未发生=0，发生=1)，以miR-21-3p、IL-18、HDL-C、LDL-C、Scr、BUN、hs-CRP、Cys C、Ranson评分为自变量，纳入多因素Logistic回归模型。结果发现，miR-21-3p、IL-18、Scr、BUN、hs-CRP、Cys C、Ranson评分均为SAP患者AKI发生的独立危险因素(P均<0.05)。见表3。

表3 SAP患者住院期间AKI发生的多因素Logistic回归分析结果

2.3 血清miR-21-3p、IL-18水平对SAP患者AKI发生的预测价值分析 ROC曲线分析显示，血清miR-21-3p相对表达量预测SAP患者AKI发生的曲线下面积(AUC)为0.786(95%CI：0.703～0.852)，最佳截断值为1.93，此时其预测SAP患者AKI发生的灵敏度为79%、特异度为81%；血清IL-18水平预测SAP患者AKI发生的AUC为0.769(95%CI：0.687～0.835)，最佳截断值为137.85 pg/mL，此时其预测SAP患者AKI发生的灵敏度为78%、特异度为76%；二者联合预测SAP患者AKI发生的AUC为0.858(95%CI：0.773～0.927)，其预测SAP患者AKI发生的灵敏度为87%、特异度为83%。血清miR-21-3p、IL-18水平联合预测SAP患者AKI发生的AUC高于二者单独(Z分别为2.172、2.451，P均<0.05)。见图1。

图1 血清miR-21-3p、IL-18水平预测SAP患者AKI发生的ROC曲线

3 讨论

SAP发生时能够释放大量炎症因子，这些炎症因子随着血液循环到达全身各个组织器官，而肾脏血运丰富，是最容易受累的器官，极易引起AKI。SAP患者AKI发生后肾功能通常呈不可逆性损伤。因此，早期预测AKI的发生风险并及时进行干预，是改善SAP患者预后、降低病死率的重要措施。Scr是临床预测AKI的常用指标，但Scr升高一般发生在肾脏受损72 h后，存在诊断滞后性。此外，Scr易受性别、年龄、肌肉含量等因素影响。BUN也是临床预测AKI的常用指标，但其灵敏度较差[10]。因此，寻找灵敏度高、特异度强的生物标志物辅助早期预测SAP患者AKI发生成为临床研究的热点。

miRNA是一类长度为18～25个核苷酸的内源性非编码RNA，在真核生物中广泛存在。miRNA通过在转录后水平调控靶基因的表达，介导细胞的增殖、分化、凋亡等生物学过程。有研究报道，部分miRNA可作为评估SAP治疗效果和患者预后的生物标志物[11]。JONES等[12]研究发现，miRNA可通过参与细胞增殖、分化、代谢等信号传导通路对细胞产生损伤，进而调控AKI的发生、进展。miR-21-3p属于miRNA家族成员之一，能够参与肾脏疾病的发生、发展。PU等[13]研究报道，在大鼠AKI模型中血清miR-21-3p水平明显升高，并且其水平升高发生在Scr、BUN之前。提示miR-21-3p可作为早期诊断AKI的生物标志物。GAEDE等[14]研究发现，血清miR-21可作为心脏手术患者AKI发生的预测指标。吴仕燕等[15]研究显示，血清miR-21-3p是脓毒症患者AKI发生的独立预测指标，其预测脓毒症患者AKI发生的AUC为0.863。但血清miR-21-3p能否用于预测SAP患者AKI发生尚不清楚。本研究结果发现，AKI组血清miR-21-3p相对表达量明显高于非AKI组，提示miR-21-3p可能参与SAP患者AKI发生。多因素Logistic回归模型在校正可能的混杂因素后发现，miR-21-3p仍然是SAP患者AKI发生的独立危险因素。miR-21-3p主要由损伤的肾组织合成，能够参与肾小管上皮细胞凋亡的调控。张盼等[16]研究发现，当肾脏出现损伤时，机体通过代偿性机制刺激损伤的肾组织释放miR-21-3p，减轻肾脏缺血再灌注损伤并促进肾小管上皮细胞增殖，从而保护损伤的肾组织；但当机体大量释放miR-21-3p时，会通过刺激PTEN、PDCD4/Fasl来阻止肾小管上皮细胞凋亡，同时活化TGF-β，加速肾组织纤维化，最终导致AKI发生。此外，岳飞利等[17]研究表明，血清miR-21水平与AKI严重程度呈正相关关系，即血清miR-21水平越高，AKI病情越严重。

IL-18是一种主要由近端肾小管中单核—巨噬细胞合成并分泌的前炎症因子。肾功能损伤后通常在尿液中能够检测到IL-18，AKI发生后尿液IL-18水平会显著升高[18]。王魁彬等[19]研究发现，窒息并发AKI的新生儿尿液IL-18水平显著升高，并且尿液IL-18可作为临床辅助诊断窒息新生儿AKI发生的早期可靠指标。SONG等[20]研究证实，脓毒症并发AKI患者尿液IL-18水平明显升高，并且尿液IL-18水平诊断脓毒症并发AKI的AUC为0.768。现有的研究主要观察尿液IL-18水平与AKI发生的关系，但SAP患者可能出现持续性无尿或少尿症状，这可能影响尿液IL-18水平对SAP患者AKI发生的预测价值。本研究结果发现，AKI组血清IL-18水平明显高于非AKI组，提示IL-18可能参与SAP患者AKI发生。多因素Logistic回归模型在校正可能的混杂因素后发现，IL-18仍然是SAP患者AKI发生的独立危险因素。SAP患者病情加重能够刺激淋巴细胞大量合成并释放IL-18，形成由复杂细胞因子调节网络介导的爆发性炎症反应，加重免疫功能紊乱，继而引起肾脏缺血再灌注损伤、肾小管毛细血管微循环障碍等，最终导致AKI发生，并且IL-18合成和释放越多，炎症反应越强烈，AKI病情越重。

本研究ROC曲线分析显示，血清miR-21-3p、IL-18水平预测SAP患者AKI发生的AUC分别为0.856、0.829，说明二者对SAP患者AKI发生均具有一定预测价值。血清miR-21-3p、IL-18水平联合预测SAP患者AKI发生的AUC为0.920，明显高于二者单独，提示血清miR-21-3p、IL-18水平联合能够提高对SAP患者AKI发生的预测价值。

综上所述，血清miR-21-3p、IL-18是SAP患者AKI发生的独立危险因素；血清miR-21-3p、IL-18水平对SAP患者AKI发生均具有一定预测价值，二者联合时预测价值更高。