博落回提取物对大豆孢囊线虫抑制活性研究

李 健，刘友花，解福双，王 丹，郭志刚

（浙江清华长三角研究院，浙江嘉兴 314000）

0 引言

大豆孢囊线虫病是由大豆孢囊线虫Heterodera glycines Ichinohe引起的一种世界性大豆病害[1]，农业上主要以优化栽培模式、施用化学药剂等方式进行防治，但收效低且易引起环境污染等问题[2]。植物中的天然代谢产物大多具有高效低毒、对环境友好等特性，将其开发成杀线虫农药，对线虫防治及绿色农药发展具有重要意义。博落回Macleaya corada（Willd）R.Br属于罂粟科Papaveraceae博落回属Macleaya，是一味常用中药，已有学者对其提取物杀菌或药理活性进行试验[3]。但对其杀虫活性研究较少，现有杀虫研究方向主要为鳞翅目[4]、双翅目的害虫。

为解决化学农药所带来的食品安全性问题，本文对博落回粉末分离提取，将提取物进行追踪活性实验，研究博落回提取物对大豆孢囊线虫幼虫是否具有致死活性，以求用植物源物质对大豆孢囊线虫进行防控，实现防治大豆胞囊线虫的目标。

1 实验方法

1.1 实验材料

1.1.1 仪器：柱色谱正相硅胶（200~300目），青岛海洋化工厂。HPLC仪器，LC-20A型液相色谱仪（日本岛津公司）；MPLC采用Dr Flash-S分离纯化系统（苏州汇通有限公司），色谱柱为ODS（C18，MB100 40~75μm，Fuji，日本）。江南NSZ-608T三目体式显微镜，南京市鼓楼区淘微视光学仪器销售部。

1.1.2 材料：博落回粗粉购于长沙上禾生物有限公司，由郭志刚教授鉴定，并存放于浙江清华长三角研究院1801标本柜。大豆孢囊线虫（H.glycines），自浙江省嘉兴市秀洲区油车港镇一大豆种植地分离得到。灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），取自西北农林科技大学植物保护学院，存放于浙江清华长三角研究院1801标本柜。6cm培养皿，24孔板，人工气候箱，移液枪，PDA培养基，无菌水，乙醇，石油醚，乙酸乙酯，丙酮，乙醇。

1.2 提取和分离

博落回粗粉20 kg，用75%乙醇回流提取2次，得到乙醇提取液。乙醇提取液经减压浓缩后依次用石油醚和乙酸乙酯萃取3~4次，经HPLC检验石油醚部位提取物和乙酸乙酯部位提取物成分类似，合并记为M。M经正向硅胶柱层析，增加梯度洗脱，经TLC检查合并，得到M1~M8共8个部分（M2发霉，不进行试验），根据活性追踪结果，将有效部分经MPLC分离，TLC板以及HPLC分析验纯，得到二次分离提取物。

1.3 大豆孢囊线虫培养方法

将灰葡萄孢菌接种到PDA培养基中，置于人工气候箱培养（T=26℃，RH=72%，光周期光：暗=14：10）。菌丝长满后，取200 μ l线虫原液加入培养皿中，送回人工气候箱培养，待培养皿中的菌丝被线虫食尽，取2 ml无菌水冲洗培养皿上盖，将冲洗液吸取至1.5 ml的离心管中，得到线虫液A，备用。

1.4 大豆孢囊线虫实验方法

取1 ml无菌水加入到新的2 ml离心管中，再取10 μ l线虫液A转移至该离心管中得到稀释后的线虫液B，混匀后取50 μ l线虫液置于显微镜下观察计数，重复3次，得到线虫密度。

利用24孔板进行实验。每个实验处理中，线虫数50条左右，单个处理含药量为1 mg/mL。实验组：50 μ l线虫液B，10 μ l药液（浓度100 mg/ml）+1 ml无菌水，单个实际药物量1 mg，6个重复（3个重复用于统计24h效果，6个重复用于统计48h效果）。对照组：50 μ l线虫液B，10 μ l丙酮液+1 mL无菌水，3个重复。

1.5 计数方法

处理24h，48h后，用NaOH溶液刺激法判断大豆孢囊线虫是否死亡并计数记录。用Excel软件计算校正死亡率[5]。24h致死率%=（24h线虫存活数-初始线虫数）/初始线虫数*100%；48h致死率%=（48h线虫存活数-初始线虫数）/初始线虫数*100%。杀线虫强弱分级[6]：校正死亡率≤10，无活性“－”；10.1%≤校正死亡率≤30%，弱活性“＋”；30.1%≤校正死亡率≤50%，中等活性“＋＋”；50.1%≤校正死亡率≤80%，较强活性“＋＋＋”；80.1%≤校正死亡率，强活性“＋＋＋＋”。

2 博落回提取物对大豆孢囊线虫的抑制作用

2.1 博落回粗提物对大豆孢囊线虫的致死效果

根据博落回提取物对大豆孢囊线虫的测定结果（表1）。24h处理后，M1、M3、M5、M6部杀虫效果较弱。M4、M7、M8部对大豆孢囊线虫的致死能力较强强，活性强度为“＋＋＋”。48h处理后，M1、M5、M6部致死率有所提升，达50%以上，M3和M8部校正死亡率降低，M4和M7部对致死效果略微提升，活性强度为“＋＋＋”。

表1 博落回粗提物对大豆孢囊线虫24h及48h致死效果

2.2 博落回二次提纯粗提物对大豆孢囊线虫的致死效果

依据粗提物的药效结果，将M4进行二次提纯，共分得10个段，M4-1~M4-10（配置药剂前，M4-1发霉，故不进行试验）。根据博落回二次纯化提取物对大豆孢囊线虫的测定结果，具体测定结果见表2。

表2 二次提纯博落回粗提物对大豆孢囊线虫致死效果

24h处理后，M4-2、M4-3、M4-5~M4-10对大豆胞囊线虫致死活性较弱，M4-4对大豆胞囊线虫的致死效果极强，活性强度达“＋＋＋＋”。48h处理后，M4-2、M4-5、M4-8、M4-9致死效果下降，M4-3和M4-6活性不变，M4-7，活性略微提升，活性强度“＋＋＋”，M4-4活性稳定，活性强度“＋＋＋＋”。

3 结语

目前约有102科226属316种植物被报道具有杀线虫或抑制线虫活性[7]，但大多未被开发成防治药剂。博落回是一种常见植物，作为杀虫药剂来源，具有资源丰富，低毒高效的优势，目前已有农药公司利用博落回提取物开发出1%血根碱可湿性粉剂（5%博落回生物碱）用于防治菜青虫等害虫[8，9]。根据本研究结果，可知博落回提取物M4具有较高的杀虫活性，其二次分离得到的M4系列的提取物中，M4-4具有极强杀虫活性，且具有长效性。

因此，博落回主茎粉末提取物对大豆孢囊线虫有较强致死作用，博落回粗提物中存在对大豆胞囊线虫具有致死活性的物质，具有开发成防治大豆孢囊线虫的潜力。今后，随着对博落回提取物进一步分离并对其单体化合物的杀线虫活性的深入试验研究，有望将其开发成一种新型防治大豆孢囊线虫的生物农药。