老年患者喉癌预后相关基因探索及预测模型建立

周荧，张志存

南京医科大学附属淮安第一医院耳鼻咽喉头颈外科，江苏淮安223300

据估算，2021年美国喉癌新增病例14 250 例，死亡4 113 例[1]。新发喉癌病例约占所有新发癌症病例的0.8%，其死亡率约占所有癌症死亡率的0.6%[2]。随着烟草使用的减少，过去10年中，喉癌的发病率每年下降2.4%[2-3]。但值得注意的是，喉癌的5年生存率约为60.9%，在过去数年中几乎没有变化[2,4]。早期T1 和T2 肿瘤的治愈率高达80%～90%。相反，在出现晚期喉癌的患者中，生存率降低至40%。喉癌需要复杂的治疗策略和长期的随访，给患者带来严重的经济负担，显著降低患者生活质量[5-6]。目前对喉癌患者的预后相关因素的研究多集中于性别、年龄、肿瘤分期分级和治疗方案等。研究[7]表明，淋巴结转移和治疗方案是喉癌患者预后的独立危险因素。也有研究[8]指出，术前血小板淋巴细胞的比值可用于判断喉癌患者预后。近年来的一些研究[9-10]发现了一些与喉癌预后相关的基因，包括等。但是基于基因表达量精准评估患者生存率的研究相对较少。本研究旨在针对老年喉癌患者，筛选喉癌中差异表达的mRNA 以及预后相关mRNA，并构建预后风险评估模型，从而将喉癌患者预后评估量化，更加直观的判断患者预后。

1 资料和方法

1.1 一般资料 从 TCGA 数据库和 GEO 下载（GSE142083, GSE117007 和GSE127165）喉癌RNASeq 和临床信息数据集，临床数据信息包括患者年龄、性别、肿瘤分级、肿瘤分期、生存时间和生存状态等。本研究针对老年喉癌患者，因此筛选年龄＞60 岁的样本，其中喉癌组织163 例，正常喉组织43 例。163例喉癌患者临床资料如表1 所示。

表1 喉癌患者一般资料

1.2 方法

1.2.1 矩阵整理 将下载的TCGA 数据集和GEO 数据集整理为行名为基因代码，列名为样本信息，内容为基因相对表达量的数据矩阵。将数据矩阵进行对数转换。合并TCGA 矩阵和GEO 矩阵，并进行批次校准，去除实验条件对基因表达量的影响。

1.2.2 差异表达基因筛选 根据Ensemble 数据库中人源性基因信息筛选指导蛋白质合成的mRNA。使用R软件和edge R包对喉癌组织和正常喉组织进行差异分析，计算mRNA 差异表达倍数（fold change, FC）。计算公式为FC=喉癌平均表达量/正常喉组织表达量。计算结果进行对数运算，最终以log2FC 的形式表达。本研究喉癌组织差异表达mRNA 筛选的2 个条件为（1）log2FC 绝对值＞2；（2）错误发现率（false discovery rates，FDR）＜0.05。

1.2.3 预后相关基因筛选 整理喉癌患者临床资料中的生存状态和生存时间。通过单因素COX 分析筛选与预后相关的差异表达mRNA。筛选标准为0.001。根据基因表达量中位数将患者分为表达组和低表达组。使用Kaplan-Meier Plotter 曲线进行生存分析，并使用Log-Rank 检验。

1.2.4 预后评估模型建立与评价 通过多因素COX 分析，构建预后评估模型，根据预后模型评分将喉癌患者分为高危组与低危组，使用Kaplan-Meier Plotter 曲线进行生存分析，并使用Log-Rank 检验。使用ROC曲线对预后评估模型进行评价。

1.2.5 统计学分析 本研究使用R 软件（V3.5.1）和相关R 包对数据进行统计学分析0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 差异表达的mRNA筛选 共筛选出1 796 个mRNA在喉癌患者肿瘤组织和正常喉组织中的表达量存在明显差异(|log2FC|＞2, FDR＜0.05)，其中835 个mRNA表达上调，961 个mRNA 表达下调。以下是差异表达最显著的前20 个mRNA。见表2。

表2 差异表达最显著的前20 个基因

2.2 差异表达mRNA 预后相关性分析 基于喉癌组织和正常组织中差异表达的mRNA，同时结合样本的生存时间和生存状态，本研究进行单因素COX 分析。以＜0.001 为筛选条件，共有16 个mRNA 与患者预后相关。其中，13 个mRNA 为影响预后的危险因素，表达量越高，患者预后越差（Hazard ratio＞1,＜0.001）；3 个mRNA 为影响预后的保护因素，表达量越高，预后越好（Hazard ratio＞1,0.001）。见表3。

表3 差异免疫基因预后相关性分析

2.3 预后评估模型建立 基于单因素COX 筛选结果，进一步通过多因素COX 分析构建预后评估模型。预后评估模型计算公式为危险评分=CCR8×0.129+CDC20×0.086+TFPI-2×0.096。构建预后风险评估模型的mRNA 森林图。见图1。

图1 构建预后风险评估模型的mRNA 森林图

2.4 高风险患者与低风险患者生存分析 根据预后风险值计算公式计算所有样本风险值。以中位值为界限，高于中位值的为高风险患者，低于中位值的为低风险患者。对高风险患者和低风险患者进行生存分析，低风险患者预后显著优于高风险患者＜0.001）。见图2。

图2 高风险患者与低风险患者生存分析

2.5 预后风险评估模型评价使用ROC曲线评价预后风险评估模型。曲线下面积为0.797，大于0.6，表明预后风险评估模型效能较好。

图3 预后风险评估模型ROC 曲线

3 讨论

淋巴结受累是影响生存最重要的预后因素[11-12]。淋巴结受累的喉癌患者5年存活率仅有未累及淋巴结患者生存率的一半。喉癌累及部位对患者预后也存在一定影响。声门肿瘤比声门上或声门下肿瘤预后更好。原发肿瘤体积与放疗获得的局部控制率密切相关。放疗时间与局部控制率和存活率均相关。气管切开被证明降低患者存活率，可能与增加了造口复发的风险相关[11-12]。此外，一些基因（如和在喉癌中的表达量增加，BCL2 可能对喉癌的预后有影响[13-14]。TNM 分类不足以区分喉癌患者预后类别，往往忽略了一些高度恶性的因素[11-12]。本研究旨在针对老年喉癌患者，筛选喉癌差异表达的mRNA 以及预后相关的mRNA，并构建预后风险评估模型，以期为临床决策提供依据。

本研究通过公共数据库对喉癌组织和喉正常组织全转录组测序结果，相较正常组织筛选出喉癌组织中差异表达的mRNA。本研究共筛选出1 796 个mRNA在喉癌患者肿瘤组织和正常喉组织中的表达量存在明显差异，其中表达上调的mRNA 有835 个，表达下调的mRNA 有961 个。进一步结合差异表达mRNA表达量和样本生存信息进行了单因素COX 分析，筛选出与预后相关的16 个mRNA。值得注意的是，其中部分基因在喉癌中的作用已经得到了研究或证实。郭星等[15]通过喉癌组织和癌旁正常黏膜组织标本采用免疫组化实验证实，BRMS1 在癌旁正常黏膜组织中高表达，而CD44v 在喉癌组织中高表达。且2 种蛋白表达量负相关。该研究还进一步发现CD44v 高表达患者预后差于CD44v 低表达患者。胡俊兰等[16]通过20 例癌旁组织和12 例正常喉黏膜组织，采用流式细胞术同样证实CD44v 在喉癌组织中高表达。郑刚等[17]通过分析TCGA公共数据库分析发现HOXA13在喉癌组织中高表达，其表达量越高，患者生存率越低。其研究还证实HOXA13 是喉癌预后独立危险因素。何时知等[18]通过基因表达谱芯片筛选发现BMP1在喉癌组织中高表达，并认为是关键致病基因，且其表达量与肿瘤分期正相关。

预后评估模型计算公式为危险评分=CCR8×0.129+CDC20×0.086+TFPI-2×0.096。本研究采用的危险评分公式是基于COX 比例风险模型构建的。这是一种半参数回归模型，可以用于分析一个或多个前定变量对患者生存时间的影响。使用这一模型建立了积累生存函数，即本研究的危险评分公式。在构建模型的3 个基因中，早期研究[19]认为，CDC20 可以介导肿瘤细胞APC/C 检查抑制。近年来的研究[20]证实，CDC20 在肺腺癌和食管癌中均起到促癌作用，并且与预后不良密切相关。研究[21]证实，CCR8 可以介导Akt/PRAS40/mTOR 通路参与食管鳞癌进展；CCR8 重编程乳酸脱氢酶亚型表达与肿瘤的不良临床结局相关。还有研究发现，在肌肉浸润性膀胱癌中CCR8 通过肿瘤内调节性T 细胞的不稳定引发抗肿瘤免疫。由此可见CCR8 在多种肿瘤的发生和进展中发挥重要作用[22]。有研究证实，TFPI-2 的表观遗传失活是与胰腺导管腺癌的生长和侵袭相关的常见机制[23]。TFPI-2 在宫颈癌、非小细胞肺癌中均发挥重要的致病作用[24-25]。近年来的一些研究发现了一些与喉癌预后相关的基因，包括等。但是这些研究也仅仅明确了基因表达量高低与预后的相关性，并没有依据严格的统计学方法建立直观预测患者生存率的模型。另外，也有研究证实临床变量，包括淋巴结转移、肿瘤原发灶大小、治疗方案选择等，可用于判断患者预后。本研究构建的模型具有独特的优势，一是可以基于基因表达进行计算，精准预测患者生存率；二是ROC 曲线证实模型效能较好；三是模型公式纳入变量少，临床应用便捷。

本研究发现通过该模型区分患者高风险与低风险，低风险患者预后较高风险患者预后好。ROC 曲线评价预后风险评估模型，曲线下面积为0.797，大于0.6，表明预后风险评估模型效能较好。

本研究筛选出了喉癌中差异表达的mRNA，并确定了与预后相关的差异表达mRNA，据此构建了预后风险评估模型，可以准确评估喉癌患者生存率，将患者预后和基因表达量进行结合，以期为临床决策提供依据。本研究存在一些缺陷：一是缺乏外部数据对模型进行验证；二是缺乏体内和体外实验进行验证，这些基因在喉癌中的致病机制尚不清楚，需要进一步的研究明确。

综上所述，CDC20、CCR8 和TFPI-2 在喉癌组织中高表达，与预后不良相关，可能是喉癌关键致病基因和潜在指标靶点。本研究构建的预后风险评估模型，效能较好，可以准确预测喉癌患者预后情况。