盐酸林可霉素可溶性粉含量测定方法

董书香，王 峻，陈向丹，丁 阳

（湖北省兽药监察所，武汉 430070）

林可霉素（lincomycin）是由链霉菌产生的一种林可胺类碱性抗生素，其作用机制与红霉素非常相似，通过抑制微生物蛋白质的合成而产生作用［1］。对革兰氏阳性球菌［2］，如葡萄球菌、溶血性链球菌和肺炎球菌作用较强，对厌氧菌如破伤风梭菌、产气荚膜芽孢杆菌也有抑制作用［3］；对支原体螺旋体有效，对弓形体也有一定作用，兽药临床上广泛用于敏感菌所致的畜禽细菌性疾病的治疗，且效果显著［4］。盐酸林可霉素在治疗各种感染中得到了广泛应用，因此建立盐酸林可霉素快速而有效的含量检测方法尤为重要。目前，盐酸林可霉素的含量测定方法有色谱法、质谱法、光谱法［5，6］。兽用盐酸林可霉素可溶性粉，收录于《兽药质量标准》（2017年版）化学药品卷［7］，其中采用高效液相色谱法对含量进行测定。该方法使用的流动相为0.05 mol/L硼砂溶液（用85%磷酸溶液调节pH至6.0）-甲醇（4∶6，V/V），在实际试验过程中，发现该流动相中使用了高浓度硼砂盐溶液，硼砂是含10个水分子的化合物，放置时间过长容易失水风化，导致配制的流动相中硼砂浓度超过标准浓度［8］，且高浓度盐溶液对色谱柱和液相系统都有较大的损害，长期处于高浓度盐溶液环境中，将大大缩短色谱柱和仪器的使用寿命［9］。研究一种新的液相色谱方法来改善以上问题，即可提高检测效率，又可以延长仪器和耗材寿命。本研究优化了高效液相色谱流动相，探讨了高效液相色谱法测定盐酸林可霉素可溶性粉含量的方法，并对方法进行了验证。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

林可霉素对照品（中国兽医药品监察所，含量：84.6%，批号：K0101503）；甲醇、乙腈（安徽天地高纯溶剂有限公司）为色谱纯；硼砂（国药集团化学试剂有限公司）为分析纯；磷酸氢二铵（国药集团化学试剂有限公司）为分析纯；水为二次纯化水；盐酸林可霉素原料，辅料，10%盐酸林可霉素可溶性粉样品（批号为201905311、202005081、202005201）均由武汉某兽药公司提供。

1.2 仪器

岛津20AD高效液相色谱仪配紫外检测器；Met⁃tler AE240电子天平；MILIPORE超纯水处理器等。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱，4.6 mm×150 mm，粒径5μm；流动相：0.02 mol/L磷酸氢二铵-乙腈（75∶25，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：214 nm；柱温：30℃；进样量：10μL。

1.3.2 溶液的配制 精密称取林可霉素对照品20 mg，置25 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密称取盐酸林可霉素可溶性粉供试品0.2 g，置25 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品溶液。

1.3.3 线性试验 精密称取林可霉素对照品100 mg，置25 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为4 mg/mL贮备液。分别精密量取贮备液适量，用流动相分别稀释至浓度为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、2.4、4.0 mg/mL的溶液，各取10μL进样，记录色谱峰面积，以浓度（C，mg/mL）为横坐标，峰面积（mV）为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.4 专属性试验 按“1.3.1”色谱条件，分别取供试品辅料空白溶液、对照品溶液以及供试品溶液注入液相色谱仪，考察专属性。

1.3.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液（林可霉素0.8 mg/mL）10μL，按“1.3.1”色谱条件，连续重复进样6次，记录色谱峰面积，计算相对标准偏差RSD，考察精密度。

1.3.6 稳定性试验 取同一供试品溶液（批号201905311）（林可霉素0.8 mg/mL），按“1.3.1”色谱条件，在不同时间（0、1、2、4、6、8、10、12、24 h）分别进样10μL，记录色谱峰面积，计算相对标准偏差RSD，考察稳定性。

1.3.7 重复性试验 精密吸取同一供试品溶液（批号201905311）（林 可 霉 素0.8 mg/mL）10μL，按“1.3.1”色谱条件，连续重复进样6次，记录色谱峰面积，计算相对标准偏差RSD，考察重复性。

1.3.8 回收率试验 配制10%的盐酸林可霉素可溶性粉，分别精密称取16、20和24 mg的林可霉素对照品及0.2 g的辅料置25 mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，按“1.3.1”色谱条件进行测定，按外标法计算林可霉素的含量，计算回收率。

1.3.9 样品的测定 分别取同一厂家不同批号的盐酸林可霉素可溶性粉，按“1.3.1”色谱条件进行测定，每个样品制备2份，计算样品中林可霉素的含量，取平均值。同时与《兽药质量标准》（2017年版）化学药品卷的色谱条件比较。

2 结果与分析

2.1 线性试验

以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归（图1），得回归方程：y=2×106x+473 55，R2=0.999 7。可见在此色谱条件下林可霉素在0.1～4.0 mg/mL范围内线性良好。

图1 林可霉素的线性回归

2.2 专属性试验

色谱图中林可霉素峰与各杂质峰分离效果好，含量测定不受其他杂质峰的干扰，色谱图见图2、图3、图4。

图2 林可霉素可溶性粉辅料空白溶液的HPLC图

图3 林可霉素对照品溶液（0.8 mg/mL）的HPLC图

图4 林可霉素可溶性粉供试品溶液（0.8 mg/mL）的HPLC图

2.3 精密度试验

连续进样6次，测得林可霉素峰面积平均值为1 841 314，RSD为0.3%。该方法表明精密度良好。

2.4 稳定性试验

在不同时间（0、1、2、4、6、8、10、12、24 h）分别进行测定，测得林可霉素峰面积平均值为1 886 971，RSD为0.4%，表明供试品溶液在室温下24 h内性质稳定。

2.5 重复性试验

连续进样6次，测得林可霉素峰面积平均值为1 890 536，RSD为0.2%，表明该方法重复性良好。

2.6 回收率试验

加样回收率考察结果见表1。结果表明，林可霉素峰平均回收率为99.5%，RSD为1.2%，表明该法符合试验分析要求，准确度高。

表1 盐酸林可霉素可溶性粉的回收率试验结果（n=9）

2.7 样品的测定

分别取同一厂家不同批号的样品，采用“1.3.1”色谱条件进行测定，试验结果见表2。样品测定结果中可以看出，该方法与其他两个色谱条件测定的结果基本一致。

表2 样品含量测定结果（标示量//%，n=2）

2.8 耐用性

比较了InertSustain C18（4.6 mm×150 mm）和Agi⁃lent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm）色谱柱。结果表明，两者均可使林可霉素分离度，理论塔板数良好，选择温度为25℃和35℃时，除出峰时间发生变化外，其余变化很小；将流动相水相和有机相比例调整为（70∶30，V/V）和（80∶20，V/V）进行测试，表明流动相比例的微调也仅能影响出峰时间，对峰形和理论塔板数影响甚小。不同品牌的色谱柱、不同流动相、有机相与水相比例以及不同温度，均能满足试验需要，该方法耐用性较好。

3 小结

在波长选择上，由于林可霉素在200 nm有最大吸收，但该处容易受溶剂干扰［10］，因此本研究沿用《兽药质量标准》（2017年版）化学药品卷的214 nm作为检测波长。该方法测定盐酸林可霉素可溶性粉的含量，与《兽药质量标准》（2017年版）化学药品卷方法比较，结果基本一致。该方法使用了溶解性较好的磷酸氢二铵作为水相溶质，且配制流动相时不需要调节pH，缩短了时效，减少了盐溶液对色谱系统的污染，提高了色谱系统的稳定性，同时操作简便、快速，重现性好，专属性强，结果准确可靠，可作为该制剂的含量测定方法的参考，特别是在兽药企业内部质量控制方面也有一定的指导作用。