发酵中药制剂对肉鸡生产性能、免疫功能、肠道形态及盲肠菌群影响的研究

王 丹，崔卫涛，王 纯，况世昌，许青荣，肖运才，李自力，周祖涛

（华中农业大学动物医学院/湖北省预防兽医学重点实验室/生物发酵制剂湖北省工程研究中心，武汉 430070）

抗生素自1950年开始被应用于畜禽养殖业，在一定时期和程度上对全球畜牧业的发展作出了卓越贡献。然而由于抗生素的不规范使用导致的危害日益凸显，如耐药菌株增加、畜禽肠道正常菌群紊乱、动物免疫力下降以及畜禽产品抗生素残留等［1］。因此，在畜牧业生产中，寻找无副作用、促生长效果良好的绿色无公害的抗生素替代品是必然趋势。

中草药是中国5 000多年历史的传承，中草药饲料添加剂具有纯天然、无抗药性、较低或无毒副作用等优点。中药含有多糖、生物碱、有机酸、苷类等有效成分，可促进动物生长发育、提高免疫力，同时对动物肠道微生物菌群和胃肠道结构产生影响［2］。然而中草药使用也存在一定的限制：使用剂量大、性味苦涩和有效成分利用率较低，因此衍生出益生菌发酵中药制剂。研究表明，中草药经微生物发酵后，其有效成分提高，药效增强，毒副作用降低，口感改善［3］。因此，本试验采用益生菌发酵中药制剂（黄芪、杜仲、五味子、诃子），将其添加于肉鸡的饲粮中，评价对肉鸡生产性能、血清抗氧化指标、免疫器官指数、免疫因子、黏膜sIgA水平、肠道形态结构和肠道菌群的影响，为益生菌发酵中药制剂替代肉鸡日粮中抗生素的可行性提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料

益生菌发酵中药制剂：经薄层色谱鉴定为合格的发酵中药制剂，主要成分为黄芪、杜仲、五味子和诃子，由湖北华大瑞尔科技有限公司提供；15%金霉素购自金河生物科技股份有限公司。

1.2 试验动物与试验设计

288只1日龄AA肉鸡，随机分为3个组，每组8个重复，每个重复12只鸡，公母各半。基础日粮为玉米豆粕型日粮，参照NRC（1994）营养需要配制。对照组饲喂基础日粮，抗生素组饲喂含有50 g/t金霉素的基础日粮，发酵中药制剂组饲喂添加3 kg/t益生菌发酵中药制剂的基础日粮。试验周期为42 d，按照肉鸡饲喂标准进行管理。

1.3 指标测定及方法

1.3.1 生长性能指标测定 试验期间，每天记录各组采食量和鸡群数量；在试验第1天和第42天8：00分别对各组鸡群空腹称重，计算各组平均体重、平均日增重、平均日釆食量和料肉比。平均体重（g）=称重总重量/称重只数；平均日增重（g）=（末重-初重）/试验天数；料肉比=总耗料（kg）/出栏鸡总重量（kg）。1.3.2 血清指标测定 试验第42天时，每组随机抽取9只鸡，翅下静脉采血3 mL，将促凝管血样倾斜置于冰上2 h，待血液凝固血清析出后，3 000 r/min离心5 min，去除杂质取上清液，于-80℃保存。血清抗氧化指标：总超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）按试剂盒说明书方法检测，试剂盒购自南京建成生物科技有限公司。血清细胞因子与内毒素：内毒素（EDT）、IL-1β、IL-6、IL-10按试剂盒说明书上的方法检测，试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。

1.3.3 免疫器官指数检测 试验第42天时，每组随机抽取9只鸡，称取每只采样鸡空腹活体重量后颈部静脉放血处死。依次摘取胸腺、脾脏、法氏囊，用吸水纸吸取血渍，剥离表面结缔组织和脂肪后称鲜重，计算免疫器官指数：免疫器官指数（g/kg）=免疫器官重（g）/宰前活重（kg）。

1.3.4 肠道形态检测 从盲肠和回肠中段小心切取约2 cm长的组织样品，石蜡包埋切片后进行苏木素-伊红（HE）染色封片，使用日本Nikon 80i生物光学显微镜并结合NIS-Elements高清晰度彩色图文分析系统进行测量、观察和取图。每组各肠道选取6张切片测定绒毛髙度（VH）和隐窝深度（CD），并计算绒毛高度与隐窝深度的比值（VH/CD）。

1.3.5 黏膜sIgA检测 石蜡切片脱蜡后，置于柠檬酸抗原修复缓冲液（pH 6.0）进行抗原修复，放入3%过氧化氢溶液用于阻断内源性过氧化物酶，3%BSA均匀覆盖组织封闭。封闭后加一抗羊抗鸡IgA抗体，4℃反应过夜。切片稍甩干后滴加与二抗HRP标记兔抗羊IgG抗体反应，室温孵育50 min。DAB显色，复染细胞核，脱水封片，显微镜镜检，图像采集分析。

1.3.6 盲肠菌群检测 取固定位置和长度的盲肠，置于50 mL灭菌离心管中保存，于无菌超净台中称取肠道内容物，每组采集的粪便样品混合。粪便样品使用OMAGE E.Z.N.A.Bacterial DNA试剂盒提取细菌总基因组DNA。用SYBR Green I Real-time PCR检测法检测盲肠内容物中乳酸杆菌、沙门氏菌和普氏粪杆菌的含量，具体方法参考Walter等［4］、张敬平等［5］和蒋曼等［6］。每个样品3个重复，根据标准曲线计算定量结果。

1.3.7 数据处理 试验数据通过Excel 2013软件进行处理，并采用SPSS 19.0软件进行统计分析，利用ANOVA、LSD进行差异显著性检验和Duncan多重比较，试验结果以平均值±标准差（Mean±SD）表示。

2 结果与分析

2.1 发酵中药制剂对肉鸡生长性能的影响

发酵中药制剂对肉鸡生产性能的影响结果见表1。由表1可知，在试验阶段，抗生素组、发酵中药制剂组肉鸡的出栏均重显著高于对照组（P<0.05），发酵中药制剂组出栏均重比抗生素组提高了4.51%。发酵中药制剂组平均日增重比对照组和抗生素组显著提高了8.19%和4.61%（P<0.05）。在平均日采食量方面，各组差异不显著。与对照组相比，发酵中药制剂组的料肉比降低0.17（P<0.05），与抗生素组相比，发酵中药制剂组料肉比降低0.02（P>0.05）。

表1 发酵中药制剂对肉鸡生产性能的影响

2.2 发酵中药制剂对肉鸡血清抗氧化指标的影响

发酵中药制剂对肉鸡血清抗氧化指标的影响结果见表2。由表2可知，发酵中药制剂组总超氧化物歧化酶的含量高于对照组和抗生素组，但差异不显著；丙二醛含量比对照组、抗生素组分别显著降低32.22%（P<0.05）、45.63%（P<0.05）。发酵中药制剂组谷胱甘肽过氧化物酶较对照组显著提高9.77%（P<0.05），与抗生素组相比差异不显著。

表2 发酵中药制剂对肉鸡血清抗氧化指标的影响

2.3 发酵中药制剂对肉鸡免疫功能的影响

2.3.1 发酵中药制剂对肉鸡免疫器官的影响 发酵中药制剂对肉鸡免疫器官的影响结果见表3。发酵中药制剂组脾脏指数比对照组、抗生素组分别提高了22.92%（P>0.05）、9.26%（P>0.05）。法氏囊指数上，发酵中药制剂组法氏囊指数最高，但差异不显著（P>0.05）。抗生素组、发酵中药制剂组的胸腺指数显著比对照组提高了10.18%、78.44%（P<0.05），发酵中药制剂组比抗生素组提高了61.96%（P<0.05）。结果表明，肉鸡日粮中添加发酵中药制剂可以显著提高胸腺指数，增加肉鸡免疫器官比重，增强肉鸡免疫功能。

表3 发酵中药制剂对肉鸡免疫器官的影响

2.3.2 发酵中药制剂对肉鸡血清细胞因子和内毒素的影响 发酵中药制剂对肉鸡血清细胞因子和内毒素的影响结果见表4。由表4可知，发酵中药制剂组IL-1β含量较对照组、抗生素组降低34.40%（P<0.05）、28.73%（P<0.05）；发酵中药制剂组IL-6含量最高，比对照组、抗生素组提高了132.61%（P<0.05）、117.63%（P<0.05）。发酵中药制剂组IL-10含量比对照组、抗生素组提高67.88%（P<0.05）、36.85%（P>0.05）；发酵中药制剂组EDT含量较对照组、抗生素组降低了48.28%（P<0.05）、23.36%（P>0.05）。结果表明，在肉鸡日粮中添加发酵中药制剂可降低IL-Iβ、EDT含量同时，提高IL-6、IL-10的含量。

表4 发酵中药制剂对免疫细胞因子的影响

2.3.3 发酵中药制剂对肉鸡肠道黏膜sIgA的影响发酵中药制剂对肉鸡肠道黏膜sIgA的影响结果见图1。由图1可知，发酵中药制剂组回肠黏膜sIgA比对照组的提高了44.2%（P<0.05），比抗生素组的提高了43.4%（P<0.05）；发酵中药制剂组盲肠黏膜sIgA比对照组的提高了66.9%（P<0.05），比抗生素组的提高了65.5%（P<0.05）。

图1 发酵中药制剂对肉鸡肠道黏膜sIgA的影响

2.4 发酵中药制剂对肉鸡肠道结构的影响

发酵中药制剂对肉鸡肠道结构的影响结果见表5。由表5可知，抗生素组、发酵中药制剂组回肠VH/VD比对照组分别提高了100.72%（P<0.01）、156.94%（P<0.01），发酵中药制剂组比抗生素组提高了28.00%（P<0.01）；抗生素组、发酵中药制剂组盲肠VH/VD比对照组分别提高了25.32%（P<0.05）、66.06%（P<0.05），发酵中药制剂组比抗生素组提高了32.50%（P<0.05）。结果表明，在肉鸡日粮中添加发酵中药制剂可以显著提高盲肠以及回肠的绒毛高度，降低隐窝深度数值，提高VH/CD的比值。

表5 发酵中药制剂对肉鸡肠道结构的影响

2.5 发酵中药制剂对肉鸡盲肠菌群的影响

将乳酸杆菌、沙门氏菌和普氏粪杆菌的质粒标准品进行荧光定量PCR扩增，构建标准曲线（图2）。乳酸杆菌的标准曲线回归方程为y=-3.479 7x+49.346，R2为0.992 6；沙门氏菌的标准曲线回归方程为y=-1.899 4x+40.92，R2为0.992 3；普氏粪杆菌的标准曲线回归方程为y=-3.380 4x+50.819，R2为0.993 7。结果表明，线性关系好，符合试验要求，可用于后续定量分析。

图2 乳酸杆菌、沙门氏菌标曲和普氏粪杆菌的标准曲线

发酵中药制剂对肉鸡盲肠内容物菌群影响结果见表6。发酵中药制剂组乳酸杆菌含量最高，比对照组提高了40.66%（P<0.05），比抗生素组提高了24.27%（P>0.05）。抗生素组沙门氏菌含量相对于对照组增加了4.05%（P>0.05），发酵中药制剂组比对照组和抗生素组分别降低了17.76%（P>0.05）、20.96%（P<0.05）。发酵中药制剂组普氏粪杆菌数量为最高，相对于对照组提高了12.44%（P<0.05），比抗生素组提高了3.42%（P>0.05）。

表6 发酵中药制剂对肉鸡盲肠菌群的影响［单位：log（copies/g）］

3 小结与讨论

在动物养殖中，生产性能是衡量动物生长发育优劣与否的最重要指标。李雪雁等［7］使用乳酸菌发酵中药饲喂麻黄杂雏鸡，发酵中药组在试验0～3周和4～5周两个时间段的生长性能好于中药组和对照组。李宗杰［8］研究发现，复方发酵中药可以提高肉鸡的平均日增重，降低料肉比，提高特异性免疫抗体水平。贺永康等［9］用0.5%、1.0%、1.5%和2.0%的中草药添加剂（组方：白头翁、黄芪、黄连、党参、大黄等）饲喂1日龄罗氏308肉鸡，试验期42 d，试验结束后2.0%中草药添加剂组十二指肠和空肠VH/CD值较对照组提高32.02%（P<0.01）和15.44%（P<0.01）。本试验中发酵中药制剂组的平均日增重相对于对照组和抗生素组均显著提高，与对照组相比，发酵中药制剂组料肉比降低0.17（P<0.05），比抗生素组降低0.02（P>0.05），显示良好的促生长性能。小肠是机体消化和吸收的主要部位，肠壁形态结构的完整性是影响肠道健康和机体消化吸收的关键。在肠道结构方面，发酵中药制剂组回肠VH/VD值比对照组提高156.94%（P<0.01），较抗生素组增加28.00%（P<0.01）；发酵中药制剂组盲肠VH/VD值比对照组、抗生素组分别提高了66.06%（P<0.01）、32.50%（P<0.05）。本试验结果与前人研究报道一致，证实了发酵中药制剂可改善肉鸡肠道结构，促进营养物质吸收，提高肉鸡生长性能［10］。

肉鸡的免疫器官主要有胸腺、脾脏和法氏囊，其中胸腺和法氏囊为初级免疫中枢器官，脾脏为次级淋巴器官。免疫器官系数可反映动物的免疫功能状态［11］。本试验中肉鸡日粮中添加发酵中药制剂，试验42 d时，发酵中药制剂组的脾脏指数、法氏囊指数和胸腺指数比抗生素组均提高，分别增加9.26%（P>0.05）、7.69%（P>0.05）和61.95%（P<0.05）。相比抗生素组，发酵中药制剂组血清IL-1β含量降低28.73%（P<0.05）、IL-6含量提高117.63%（P<0.05）、IL-10含量提高36.85%（P>0.05）、EDT含量降低23.36%（P>0.05）。血清中IL-1β含量降低、IL-6含量升高，IL-10的含量升高以及EDT的含量较少，说明机体的炎症反应减少，机体肝脏受到的损伤机率降低［12］。分泌型IgA（sIgA）是机体防御系统的主要组成成分，由浆细胞产生，能抑制微生物在呼吸道上皮附着，尤其可以减缓细菌病毒等的生长速度，第一时间启动机制保护机体免受损伤［13］。回肠黏膜sIgA和盲肠黏膜sI⁃gA含量均提高。动物体内脂质过氧化的代谢产物包括MDA，能够反映机体受自由基攻击所受损伤的严重程度，而T-SOD可以间接反映机体清除自由基的能力，所以通常MDA含量的测定常与T-SOD活性相互配合［14］。GSH-Px是动物机体内普遍存在的一种过氧化物分解酶，可以保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害［15］。本试验中发酵中药制剂组T-SOD和GSH-Px含量较抗生素组都有提高，但差异不显著，而MDA含量降低45.6%（P<0.05）。结果表明，发酵中药制剂可增强肉鸡的免疫功能，提高抗氧化能力。

肠道菌群通过基因的演化，菌株水平基因的转移等方式在机体的健康中扮演重要的角色，起到了调节机体平衡的生物屏障作用。但是，目前滥用抗生素使得肠道菌群的平衡发生紊乱。通过研究发现益生菌可以改善肠道内微生物菌群的失调状况，通过调节菌群在机体内的作用进而降低疾病的发生几率［16］。普氏粪杆菌在动物肠道内也很常见，普氏粪杆菌在动物肠道内与动物的免疫作用息息相关，对动物的免疫功能起不可忽视的作用。陈柯源［17］将当归补血汤（DBT）使用枯草芽孢杆菌发酵，DBT发酵产物饲喂SD大鼠，对粪便微生物进行高通量测序，结果表明，DBT发酵产物显著上调植物乳杆菌含量，下调另枝菌属和副拟杆菌属等病原菌的含量［18］。本试验中发酵中药制剂组乳酸杆菌含量最高，比抗生素组提高了24.27%（P<0.05），沙门氏菌含量比抗生素组降低了20.96%（P<0.05）。发酵中药制剂组的普氏粪杆菌的数量为最高，相对于对照组提高了12.44%（P<0.05）。结果表明，发酵中药制剂提高肉鸡肠道有益菌含量，降低抑制致病菌含量，维持了肉鸡肠道菌群平衡。