高絮凝活性放线菌的鉴定和培养基组分的初步优化

田宇曦，陈 凌，闵 勇，杨自文

（湖北省生物农药工程研究中心，武汉 430064）

絮凝是将分散的小颗粒聚拢形成大絮凝物的过程，絮凝剂广泛应用于可饮用水净化、废水处理、下游处理、食品发酵工业等［1，2］。絮凝剂一般能分成3类，即无机絮凝剂、有机合成絮凝剂和天然产生的絮凝剂，其中，天然产生的絮凝剂包括海藻酸钠、壳聚糖和微生物源絮凝剂。细菌、真菌、藻类和放线菌都能产生微生物絮凝剂，包括多聚糖、功能蛋白和糖蛋白等［3］。产生微生物絮凝剂的微生物分离自淡水环境、活性污泥、土壤、啤酒废水和海洋沉积物等［4-6］。在絮凝领域，化学合成絮凝剂因为廉价和絮凝率高被广泛应用，但是其使用会引起一些环境问题和老年痴呆症等健康隐患［7，8］。用环境友好型、可生物降解的微生物源絮凝剂替代化学合成絮凝剂越来越受到关注，微生物源絮凝剂通过絮凝过程修复污染的水体，相比普通的化学絮凝更经济且环保［9］。农村污水分散，不像城市有完善的污水收集和处理系统，农村污水污染物毒性较低，可生化性好，且农村对环境安全的要求更高，微生物源絮凝剂绿色无污染，能很好地满足农村污水处理的环保要求，甚至实现资源的循环利用［10］。但是，尽管有大量微生物被发现能产生生物絮凝剂，真正商业应用的却几乎没有［11，12］。

为了开发用于农村污水治理的高絮凝活性菌株，拟对高絮凝活性放线菌ws75382进行16SrDNA鉴定，为了降低絮凝剂的生产成本，并利用单因素试验和正交试验对其培养基组分进行优化，以期获得最节省的培养组分，为今后将其在农村污水治理领域规模化应用打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株为湖北省生物农药工程研究中心菌种保藏中心保藏的放线菌。

培养基：①ISP2固体培养基：葡萄糖4 g/L，酵母粉4 g/L，麦芽浸出粉10 g/L，碳酸钙2 g/L，琼脂18 g/L，自然pH。②种子培养基：大豆粉20 g/L，葡萄糖20 g/L，硫酸铵5 g/L，氯化钠8 g/L，碳酸钙2 g/L，pH 7.0［13］。③发酵培养基：碳源、氮源、氯化钠，碳酸钙，pH 7.0。

细菌基因组提取试剂盒购自上海赛百盛基因技术有限公司，引物27F和1492R由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，高岭土和EasyTaq混合酶购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 放线菌的培养条件和絮凝率的测定

将湖北省生物农药工程研究中心保存的放线菌ws75382斜面在ISP2固体平板上划线活化，30℃倒置培养3～5 d。从活化平板挑菌块1 cm2接入装有50 mL种子培养基的500 mL三角瓶中，30℃摇床培养2 d，后将发酵液0.5 mL转接入装有50 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，30℃摇床培养2～3 d，镜检无污染后，取发酵液1.5 mL，12 000 r/min离心1 min，将发酵液上清液500μL加入20 mL 5 g/L高岭土（加有40μL 1 mol/L CaCl2，均置于带橡胶软塞的玻璃试管中）上下颠倒混匀5 min，静置3 min，取液面下1～2 cm处液体100μL至96孔板，用酶标仪在550 nm处测定吸光度OD550nm。对照是没有发酵的发酵培养 基 上清 液。絮凝 率=（OD样品-OD对照）/（OD对照-OD背景）×100%。

1.3 菌株的16S rDNA鉴定

采用细菌基因组提取试剂盒提取菌株ws75382基因组，使用细菌16SrRNA通用引物对其进行PCR扩增，引物 序列如下，27F：5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′和1492R：5′-ACGGCTACCTTGTTACG ACTT-3′。扩增体系：2×EasyTaq混合酶体系25μL，DNA模板1μL，上下游引物各1μL，加入ddH2O补足体积至50μL。PCR扩增反应条件：94℃2 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃90 s，30个循环；72℃10 min，4℃无限循环终止反应。使用浓度为1%（W/V）的琼脂糖凝胶电泳检测扩增后的产物，然后送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，获得16SrDNA完整序列信息。登录NCBI网站（www.ncbi.nlm.nih.gov），将获得的基因序列与GenBank中已知的序列进行同源性比对分析，根据所获得的相似性序列，用软件MEGA-X采用邻接法构建系统发育树。

1.4 发酵培养基组分的优化

找到种子发酵液条件下絮凝率为50%左右的发酵液稀释度，在此稀释度下进行碳氮源优化试验。①氮源试验：以种子培养基为基础，只改变氮源，考察20、15 g/L大豆粉分别与5 g/L蛋白胨、酵母浸粉和硫酸铵配合作氮源对放线菌ws75382絮凝率的影响，选出最佳氮源。②碳源试验：以种子培养基为基础，只改变碳源，考察20 g/L葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和可溶性淀粉作碳源对放线菌ws75382絮凝率的影响，选出最佳碳源。使用SPSS17.0统计分析软件进行单因素方差分析（Turkey′s HSD test，P<0.05），分析数据间的差异显著性。

正交试验同样使用相同比例稀释后的发酵液，将试验获得的最佳氮、碳源及氯化钠和碳酸钙进行正交试验L16（45），获得最佳培养基配方。

2 结果与分析

2.1 ws75382菌株的鉴定

湖北省生物农药工程研究中心保存的放线菌ws75382在种子培养基中发酵可以达91.9%的絮凝活性。种子培养基有5种培养组分且各组分浓度都偏高。ws75382的16SrDNA扩增长度为1 433 bp，通过NCBI BLAST显示其与Streptomyces cyslabdani⁃cusstrain K04-0144同源性最高，相似度为99.22%。ws75382的系统发育树（图1）显示，其与Streptomy⁃cescyslabdanicusstrain K04-0144亲缘关系最近。

图1 ws75382 16Sr DNA系统进化树

2.2 发酵培养基组分的优化

2.2.1 发酵培养基中的氮、碳源对放线菌ws75382絮凝率的影响 种子发酵液发酵条件下，ws75382发酵液和去离子水按30∶1（V/V）稀释，稀释后的发酵液上清絮凝率为64.9%，将单因素试验中各发酵液均按发酵液∶水为30∶1稀释，氮源优化结果见图2，碳源优化结果见图3。由图2可以看出，大豆粉单独作为氮源，放线菌ws75382发酵上清液絮凝率最高，显著优于在大豆粉基础上添加其他氮源，而大豆粉添加蛋白胨和酵母粉又显著优于大豆粉+硫酸铵。所以，作为氮源，大豆粉最有利于放线菌ws75382产生絮凝剂。由图3可以看出，4种碳源之间没有显著性差异，麦芽糖最有利于放线菌ws75382产生絮凝剂，其次是葡萄糖，考虑到麦芽糖成本较高，选择葡萄糖作为放线菌ws75382发酵碳源。

图2 N源优化结果

图3 C源优化结果

2.2.2 发酵培养基优化结果 根据氮、碳源单因素试验结果，选取大豆粉、葡萄糖及其他培养基成分，按L16正交表安排试验，考察各培养基组分对放线菌ws75382絮凝率的综合影响。正交试验因素与水平见表1，正交试验结果见表2，方差分析见表3。

表1 优化发酵培养基组分的正交试验因素水平（单位：g/L）

由表2直观极差分析可以看出，以絮凝率为评价指标，各因素对放线菌ws75382絮凝率的影响大小表现为A>C>D>B。最优组合为A3B3C4D2，即培养基最佳配方为大豆粉15 g/L，葡萄糖14 g/L，氯化钠8 g/L和碳酸钙3 g/L。由表3方差分析可见，大豆粉和氯化钠对放线菌ws75382絮凝率的影响极显著，与直观分析结果一致。以A3B3C4D2培养基配方进行3次验证试验，所得絮凝率接近100%，证明其是优配方。

表2 正交试验结果

表3 极差分析结果

3 小结与讨论

未优化前，培养基配方为大豆粉20 g/L、葡萄糖20 g/L、硫酸铵5 g/L、氯化钠8 g/L、碳酸钙2 g/L，放线菌ws75382絮凝率为91.9%。经过优化，培养基配方为大豆粉15 g/L、葡萄糖14 g/L、氯化钠8 g/L和碳酸钙3 g/L，放线菌ws75382絮凝率为100%。相对初始培养基，优化后的培养基不仅组分简化，氮源只需采用一种组分大豆粉，此外氮源和碳源的量分别降低了40%和30%。