QuEChERS/高效液相色谱－串联质谱法测定柑橘中7种酚类环境激素

2022-01-09杨楚悦孟桃于

分析测试学报 2021年12期

刘芳，龚芳，清江，杨楚悦，孟桃于，丁利

（1.长沙理工大学化学与食品工程学院，湖南长沙 410000；2.长沙和合医学检验实验室有限公司，湖南长沙 410000；3.上海海关工业品与原材料检测技术中心，上海 200135）

湖南是以柑橘种植为主的水果生产大省，柑橘种植面积高达全省水果种植总面积的75%。据统计，2018 年湖南省柑橘种植面积为576.1 万亩，产量为528.6 万吨，居全国第二。随着科技进步和生活水平的提高，人们对食品质量安全越来越重视，由于农产品生产链条长、环节多、生产主体分散，同时农业生态环境的恶化和禁用物质的非法添加，给农产品质量安全带来重大隐患［1］。环境激素是一类影响人体和动物体内正常激素水平的外源性化学物质［2］。目前已发现的环境激素多达70 种，包括类固醇类激素及一些类雌激素作用的化合物等［3］。其中，酚类环境激素是一种重要的化工原料，被广泛用于食品接触涂层、塑料玩具、眼镜片、药物等各类工业生产中［4－5］。研究表明，酚类环境激素具有与雌激素类似的作用，可影响生物体的生殖和发育系统［6］、神经系统［7］、免疫系统［8］等。由于生产生活中的广泛使用，双酚类环境激素在水体［9］、土壤［10］等环境中广泛存在，可能通过根部吸收在柑橘中进行富集，再通过食物链［11－12］进入生物体内，最终对人体健康产生危害［13－14］。因此，检测柑橘中的酚类环境激素对于保障人体健康具有重要意义。

目前酚类环境激素的测定对象主要为食品接触材料、水产品、尿液和奶粉等，常用的检测方法包括气相色谱－质谱法（GC－MS）［15］、液相色谱法（HPLC）［16］和液相色谱－串联质谱法（LC－MS/MS）［17］等。但GC－MS 法耗时长、前处理操作繁琐，HPLC 法分析速度慢、灵敏度和特异性低。LC－MS/MS 法分析速度快、选择性强、准确度高，被广泛应用于酚类环境激素的定量及定性分析。酚类环境激素常用的前处理方法包括酶解［18］、固相萃取［19－21］、液－液萃取［22］等。QuEChERS 具有回收率高、操作简便、分析速度快、适用范围广等优点。目前关于柑橘中环境激素的研究报道较少，仅屈芳等［23］采用固相萃取/高效液相色谱－串联质谱法测定苹果、香蕉、橘子、梨等水果中8 种环境雌激素，但该方法耗时长、前处理操作繁琐。因此，建立简单、快速的柑橘中酚类环境激素的检测方法具有重要意义。

本研究以湖南主要特色农产品柑橘为研究对象，以乙腈（含0.1%甲酸）为提取溶剂，建立了柑橘中双酚A 等7 种酚类环境激素的分散固相萃取/高效液相色谱－串联质谱测定方法。该方法操作简单、快速灵敏、定量准确、精密度高，适用于柑橘中酚类环境激素的测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱－串联质谱仪（AB4500，美国AB SCIEX 公司）；电子分析天平（MS106DU，瑞士Mettler Toledo 公司）；高速冷冻离心机（TGL－16M，湖南迈克尔仪器有限公司）；超声波振荡器（KQ2200DE，昆山超声仪器有限公司）；氮吹仪（MD－200－2，杭州奥盛仪器有限公司）；多管涡旋混合仪（LPD2500，北京莱普特科学仪器有限公司）；移液器（德国Eppendorf 公司）；PSA PAEs dSPE 专用填料（40～63 µm，60Å）、HC－C18QuEChERS 专用填料（100 g，40～63 µm）、有机系微孔滤膜（0.22µm），均购于上海安谱实验科技股份有限公司。

双酚A（BPA）、双酚B（BPB）、双酚F（BPF）、双酚S（BPS）、壬基酚（NP）、4-n-壬基酚（4-n-NP）、4-n-辛基酚（4-n-OP）标准品均购于德国Dr. Ehrenstorfer 公司；色谱纯甲醇、乙腈均购于德国Merck 公司；甲酸（FA，纯度≥96%）、乙酸铵（纯度≥99%）购于德国Sigma公司；超纯水购于中国屈臣氏集团有限公司。柑橘均购于当地市场（宜章皇帝柑1、南丰沙糖桔2、石门蜜橘3、永兴冰糖橙4、慈利纽荷尔橙5、郴州粑粑柑6、湘西椪柑7、常德蜜柚8）。

1.2 标准溶液的配制

标准储备液：分别准确称取10 mg 7种酚类环境激素标准品置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成1 g/L的标准储备液，于4 ℃保存。

中间标准溶液：用甲醇将上述标准储备液稀释成质量浓度均为10 mg/L 的中间标准溶液，于4 ℃保存。

混合标准工作液：用空白基质提取液将上述中间标准溶液稀释成系列质量浓度的混合基质匹配标准工作溶液。其中，4-n-NP、4-n-OP、BPB、BPS 的系列质量浓度为0.2、1、5、10、20、50、100µg/L，BPA、NP、BPF的系列质量浓度为0.5、2、5、10、20、50、100µg/L。

空白基质：处理方法同“1.3”。

1.3 样品前处理

称取5.0 g 均质后的柑橘样品于50 mL 离心管中，加入10 mL 乙腈（含0.1%FA）后高速匀浆3 min，加入1.5 g无水硫酸镁和1.0 g氯化钠，涡旋混匀3 min后，超声提取10 min，于10 000 r/min离心5 min，收集上清液。基质中加入10 mL乙腈（含0.1%FA）再提取1次，收集上清液。

合并2 次上清液，定容至25 mL。取10 mL 溶液置于装有50 mg N-丙基乙二胺（PSA）、50 mg C18粉末、1.0 g 无水硫酸镁的离心管中，涡旋混匀3 min，于10 000 r/min 离心5 min，取5 mL 上清液氮吹，然后用1 mL 乙腈（含0.1%FA）复溶，涡旋混匀1 min，于10 000 r/min 离心3 min，取上清液经0.22µm有机滤膜过滤后待测定。外标法定量。

1.4 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm × 2.1 mm，1.7 µm）；柱温：40 ℃；流速：0.2 mL/min；流动相：A 为水（含0.5 mmol/L 乙酸铵），B 为甲醇。梯度洗脱程序：0～0.5 min，10%B；0.5～1.0 min，10%～60% B；1.0～5.0 min，60%～100% B；5.0～6.5 min，100% B；6.5～6.6 min，100%～10%B；6.6～8.5 min，10%B；进样量：5µL。

1.5 质谱条件

离子源：电喷雾电离（ESI）源；扫描方式：负离子扫描；离子源温度（TEM）：500 ℃；雾化气（Gas1）压力：0.34 MPa；辅助气（Gas2）压力：0.38 MPa；离子喷雾电压（IS）：－4 500 V；气帘气（CUR）压力：0.24 MPa；碰撞气（CAD）压力：0.06 MPa；检测方式：多反应监测（MRM）模式。7 种酚类环境激素的质谱分析参数见表1。

表1 7种酚类环境激素的质谱参数Table 1 MS parameters of the seven phenolic environmental hormones

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

采用蠕动泵直接进样的方式，将500µg/L 的单一标准溶液以7µL/min 流速注入ESI源中，在Q1 母离子扫描模式下比较正离子模式和负离子模式的响应。结果表明，各目标物均在负离子模式下具有更强的响应。因此，实验选择在负离子模式下获得目标化合物的准分子离子峰。在子离子模式下，通过调节碰撞能，选取丰度最高的2 个碎片离子作为定量离子和定性离子，并对各离子的去簇电压、碰撞能进行优化，确定各目标物的质谱参数如表1所示。

2.2 色谱条件的优化

首先比较了甲醇－水、甲醇－水（含0.5 mmol/L 甲酸铵）、甲醇－水（含0.5 mmol/L 乙酸铵）、甲醇－水（含0.1%氨水）4 种流动相体系的分离效果，发现以甲醇－水（含0.5 mmol/L 乙酸铵）、甲醇－水（含0.1%氨水）为流动相时，7 种化合物的响应值较高、峰形好、拖尾现象减少；但以甲醇－水（含0.1%氨水）为流动相时，BPS的出峰时间大幅度提前。考虑到流动相中添加一定浓度的乙酸铵可增加负离子模式下化合物的电离效果，实验进一步对比了甲醇－水（含0.5 mmol/L 乙酸铵）、甲醇－水（含1.0 mmol/L 乙酸铵）、甲醇－水（含1.5 mmol/L 乙酸铵）、甲醇－水（含2.0 mmol/L 乙酸铵）4 种流动相体系，结果表明，7 种化合物的响应值未随着乙酸铵浓度的增加而升高，因此选择甲醇和水（含0.5 mmol/L 乙酸铵）为流动相。在MRM 模式下，7 种化合物混合标准溶液（50µg/L）的总离子流色谱图如图1所示。

图1 7种酚类环境激素（50µg/L）混合标准溶液的色谱图Fig.1 Chromatogram of seven phenolic environmental hormones（50µg/L）in mixed standard solution

2.3 前处理条件的优化

2.3.1 提取溶剂种类的选择考察了甲醇、甲醇（含0.1% FA）、乙腈、乙腈（含0.1% FA）4 种提取溶剂的提取效果（图2）。结果表明，当提取溶剂为甲醇和甲醇（含0.1%FA）时，7 种目标物的回收率较低，由于甲醇可溶解盐类，不利于液液分层，且基质中强极性的醇或有机酸等易在甲醇中溶出，不利于后续样品净化；当提取溶剂为乙腈和乙腈（含0.1% FA）时，BPA、BPB、BPS、BPF、NP 的提取率均可达到90%以上，且4-n-NP、4-n-OP 的提取率达到70%以上，而乙腈（含0.1%FA）的提取率优于乙腈，因此选择乙腈（含0.1%FA）作为提取溶剂。此外，柑橘中含有较多的水分，加入1.5 g 无水硫酸镁和1.0 g 氯化钠以促进水相和有机相分层并防止水分进入有机相。

图2 提取溶剂对柑橘中7种酚类环境激素提取率的影响Fig.2 Effect of extraction solvent on the extraction rate of seven phenolic environmental hormones in citrus

2.3.2 提取溶剂体积的选择以乙腈（含0.1%FA）为提取溶剂，考察了提取溶剂体积（5.0、7.5、10、12.5、15 mL）对提取率的影响。结果显示，提取溶剂体积为10 mL 时，7 种目标物均有较高的提取率。提取溶剂体积太小时，样品分散性较差，目标物提取率低；而提取溶剂体积太大时，有机溶剂消耗较多，易产生污染。因此，实验选择提取溶剂体积为10 mL。

2.3.3 提取时间的选择考察了不同提取时间（5、10、15、20、25 min）对柑橘中7 种目标物提取率的影响（图3）。由图可知，提取时间为5 min时，4-n-NP、4-n-OP的提取率较低；随着提取时间的增加，提取率明显提高；提取时间大于10 min后，提取率变化较小，因此选择最佳提取时间为10 min。

图3 提取时间对柑橘中7种酚类环境激素提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on the extraction rate of seven phenolic environmental hormones in citrus

2.3.4 吸附剂的优化QuEChERS 方法中最常用的吸附剂有石墨化炭黑（GCB）、PSA 和C18粉末。由于GCB 对目标物有吸附，回收率较低，因此实验考察了吸附剂的种类（PSA 粉末、C18粉末、PSA + C18粉末）和不同用量（0、25、50、75、100 mg）对7 种目标物回收率的影响。图4结果表明，7 种目标物经PSA + C18粉末净化提取后的回收率最高，原因是PSA 可通过氢键等分子间作用力有效地去除基质中的有机酸、糖类等极性分子，而C18粉末易吸附色素、维生素、脂肪等非极性或极性小的分子。通过对吸附剂用量优化发现，采用50 mg PSA+50 mg C18粉末净化的回收率最好，原因是吸附剂用量过多会吸附目标化合物，导致回收率降低；吸附剂用量过少则杂质吸附不完全。因此，最终采用50 mg PSA+50 mg C18粉末作为吸附剂。

图4 吸附剂种类对柑橘中7种酚类环境激素提取率的影响Fig.4 Effect of adsorbent types on the extraction rate of seven phenolic environmental hormones in citrus

2.4 基质效应

基质效应普遍存在于质谱分析中，主要是由于共提取物与目标分析物在电喷雾离子源上存在竞争效应，影响目标分析物电离，表现为离子增强或抑制作用［23］。分别配制系列基质匹配标准溶液和空白溶剂标准溶液，采用本方法进行测定，以基质匹配标准曲线斜率（A）与空白溶剂标准曲线斜率（B）的比值评价基质效应（ME），即ME=|A/B－1|×100%。当ME ≤20%时，基质效应较弱；当ME 为20%～50%时，基质效应为中等程度；当ME ≥50%时，基质效应较强。结果显示，BPA、BPB 的ME 分别为2.8%、9.6%，为弱基质效应；BPF、NP、4-n-NP、4-n-OP 的ME 分别为41.7%、35.6%、44.0%、33.0%，为中等程度基质效应；BPS的ME为76.7%，为强基质效应。因此，本方法选用基质匹配标准曲线进行定量。

2.5 线性关系、检出限与定量下限

按“1.2”方法配制7 种目标化合物的系列基质匹配标准溶液，采用本方法进行测定，以目标物的峰面积（y）对其质量浓度（x，µg/L）进行线性回归。结果表明，7 种目标化合物在各自的质量浓度范围内线性关系良好，相关系数（r2）均不小于0.994 1。分别以3 倍信噪比和10 倍信噪比确定方法的检出限（LOD）和定量下限（LOQ），7 种目标化合物的LOD 和LOQ 分别为0.2～0.5µg/L 和0.5～1.5µg/L（见表2）。

表2 7种酚类环境激素的线性方程、线性范围、相关系数、检出限及定量下限Table 2 Linear equations，linear ranges，correlation coefficients（r2），LODs and LOQs of seven phenolic environmental hormones

2.6 回收率与相对标准偏差

为验证方法的准确性和重复性，分别在空白柑橘样品中添加3个不同浓度水平（10、250、500µg/kg）的标准溶液，按照“1.3”方法进行预处理，每个加标水平测定9 次，计算回收率和相对标准偏差（RSD）。由表3 可知，在3 个加标水平下，7 种化合物的回收率为88.5%～109%，RSD 为1.2%～9.0%，表明该方法的准确性和重复性符合方法学要求。

表3 7种酚类环境激素的加标回收率及相对标准偏差（n=9）Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations（RSDs）of seven phenolic environmental hormones（n=9）

2.7 实际样品的测定

采用本方法对湖南省8 个不同品种的柑橘样品（宜章皇帝柑1、南丰沙糖桔2、石门蜜橘3、永兴冰糖橙4、慈利纽荷尔橙5、郴州粑粑柑6、湘西椪柑7、常德蜜柚8）进行检测。结果表明， BPF 和BPS 在所有柑橘中均未检出。BPA 在7 种柑橘中检出，检出量为0.51～1.78 µg/kg；4-n-OP 在5 种柑橘中检出，检出量为0.37～1.21 µg/kg；4-n-NP 在3 种柑橘中检出，检出量为0.26～0.59 µg/kg；NP在3 种柑橘中检出，检出量为0.66～1.77 µg/kg；BPB 在1 种柑橘中检出，检出量为0.37 µg/kg（见表4）。