HPLC 法测定复方鲜竹沥液中2,6-二甲氧基苯酚的含量

黄东，肖小武，周志强，付辉政，许妍，洪挺

江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029

复方鲜竹沥液是根据浙江省中医院杨继荪院长提供的经验方，由浙江省中医院、浙江省医学研究院与杭州天目山药业股份有限公司共同研制而成的合剂，处方由鲜竹沥、枇杷叶、鱼腥草、桔梗、生半夏、生姜、薄荷素油七味药组成。处方中鲜竹沥为君药，性寒滑利，清肺降火，化痰止咳。鱼腥草和枇杷叶共为臣药，清热解毒，化痰止咳。桔梗宣肺利咽，化痰止咳；生半夏燥湿化痰；生姜既可佐助君药化痰之力，又可佐制生半夏毒性，共为佐药。全方各药共奏清热化痰、止咳之功效［1］。复方鲜竹沥液现行标准为《中国药典》2015年版一部，标准只收载有鱼腥草、枇杷叶和桔梗的薄层色谱鉴别以及合剂常规检查项［2］，标准过于简单，且对占处方量40%的君药鲜竹沥没有任何质控指标，不能真实地反应该产品的质量。有文献报道愈创木酚类酚性成分为鲜竹沥祛痰镇咳活性成分［3-7］，《中国药典》2015年版一部中“祛痰灵口服液”品种项下，有以“愈创木酚”为指标控制鲜竹沥质量，现今关于该复方鲜竹沥液处方质量研究的文献很少［8-11］。为控制复方鲜竹沥液中君药鲜竹沥的质量，本研究运用高效液相色谱法（HPLC）测定复方鲜竹沥液中君药鲜竹沥中2，6-二甲氧基苯酚的含量。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

赛默飞Ultimate 3000 高效液相色谱仪，TE212-L型十万分之一天平（德国赛托利斯公司）。

1.2 试剂

复方鲜竹沥液（A 公司，批号190902、191206、191208；B 公司，批 号191235、B 191145；C 公司 20200211、20200212、20200302）；2，6-二甲氧基苯酚对照品（Stanford Chemicals 提供，批号MA190816-07，含量为98.0%）。乙腈为色谱纯，Milli-Q Directl 6超纯水仪（德国默克密理博公司），其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的配制

取2，6-二甲氧基苯酚对照品适量，精密称定，加适量甲醇制成20 μg/mL 的2，6-二甲氧基苯酚对照品溶液。

2.2 供试品溶液的配制

吸取复方鲜竹沥液20 mL，置分液漏斗中，加稀盐酸调pH 至1～2，摇匀，再用乙醚萃取3 次，每次30 mL，合并乙醚提取液，提取液再用5%的碳酸氢钠溶液20 mL 洗涤，分取乙醚层，挥干，残渣用适量甲醇溶解转移至2 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.3 色谱条件及系统适用性

色谱柱：ACE C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：以乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱（0～20 min，A：7%→21%；20～30 min，A：21%→29%）；检测波长为201 nm；柱温箱30 ℃；进样量：5 μL。按照该色谱条件进行测定，理论塔板数按2，6-二甲氧基苯酚峰计应不低于4 000。色谱图中显示其他组分对2，6-二甲氧基苯酚色谱峰无干扰。色谱图见图1。

图1 复方鲜竹沥液HPLC色谱图：A.2，6-二甲氧基苯酚对照品溶液；B.供试品溶液；C.缺鲜竹沥阴性对照溶液

2.4 线性关系的考察

精密称取2，6-二甲氧基苯酚对照品10.85 mg，置于50 mL 容量瓶，加适量甲醇超声溶解，再用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备溶液。再精密吸取配制的对照品储备液适量，用甲醇稀释成5个系列浓度，再按正文“2.3”项下的HPLC 色谱条件进行线性关系测定。以峰面积（Y）为纵坐标，对照品进样量（X）为横坐标，绘制标准曲线2，6-二甲氧基苯酚的线性回归方程为Y=284.69X-1.575 3，r=0.999 9，根据测定结果计算得到2，6-二甲氧基苯酚在0.043～0.43 μg 之间具有良好线性关系。

2.5 精密度试验

精密吸取配制的对照品溶液，按照上述“2.3”条件连续进样，测得6 次峰面积。再计算6 次2，6-二甲氧基苯酚峰面积的RSD 为0.5%，表明仪器精密度符合实验要求。

2.6 重复性试验

精密吸取6 份复方鲜竹沥液（批号：191206）样品各20 mL，按供试品制备方法，制备得到供试品溶液，再按HPLC 液相色谱条件进行分析，计算结果显示2，6-二甲氧基苯酚平均值为15.99 μg/mL，其RSD 为1.5%，表明所建立的方法重复性符合实验要求。

2.7 稳定性试验

取重复性实验项下制备的供试品溶液，分别在1、2、3、6、9、12、24 h 测定2，6-二甲氧基苯酚峰面积，测定结果显示其面积的RSD 为0.8%（n=7），说明2，6-二甲氧基苯酚在24 h 内稳定性较好。

2.8 回收率试验

精密量取复方鲜竹沥液（批号：191206）10 mL，各6 份，分别加入2，6-二甲氧基苯酚对照品溶液10 mL（0.016 17 mg/mL），用稀盐酸调pH 至1～2，摇匀，再按上面“2.2”方法制备，得到供试品溶液。依次精密吸取5 μL供试品溶液，进行HPLC色谱分析测定，计算回收率。计算结果显示2，6-二甲氧基苯酚的平均回收率为97.3%（n=6），RSD 为1.7%。详见表1。

表1 2，6-二甲氧基苯酚回收率试验结果（n=6）

2.9 样品测定

分别取A、B、C 三家生产企业的复方鲜竹沥液样品适量，按照“2.2”项下处理方法，每份样品平行处理2 份，得供试品溶液，再按“2.3”液相色谱条件进行测定。计算结果见表2。

表2 样品的测定结果（μg/mL）

3 讨论

3.1 实验方法考察

对新建的含量测定方法，分别考察了不同pH：用稀盐酸分别调pH 值至1～2、2～3、3～4，结果显示调节pH 值至1～2 时，供试品色谱峰峰面积最大；考察了碳酸氢钠用量：分别使用5%碳酸氢钠0、10、20、30、60 mL，结果显示使用20 mL 时，供试品峰面积最大；考察了乙醚萃取次数：分别使用乙醚萃取1 次、2 次、3 次、4 次，结果显示萃取3次已基本萃取完全。故最终确定实验方法为使用稀盐酸调节pH 至1～2，用乙醚振摇提取3 次，用5%的碳酸氢钠溶液20 mL 洗涤。

3.2 2，6-二甲氧基苯酚的选择

鲜竹沥为禾本科植物粉绿竹Phyllostachys glaucaMcCluve、净 竹Phyllostachys nudaMcClure及同属植物的鲜杆经加热后自然沥出的液体［12］。鲜竹沥传统炮制方法历代本草均有记载，主要有两种方法，一种方法为：“将竹截作二尺长，辟开。以砖两片对立，架竹于上。以火炙出其沥，以盘承取”，简称直接火烧法；另一种方法为：“以竹截长五六寸，以瓶盛，倒悬，下用一器承之，周围以炭火逼之，其油沥于器也”，简称装盘倒悬炭火逼制法。前期课题组自制了直接火烧法34 批次，干馏法27 批次鲜竹沥，对其进行检测，均含有酚性成分，且以2，6-二甲氧基苯酚含量最大，且有文献报道鲜竹沥和复方鲜竹沥液中均含有愈创木酚类祛痰镇咳活性成分［3-7］，故选择其作为质控指标。

3.3 结果分析

从检测结果可看出，A 和B 公司不同批次复方鲜竹沥液2，6-二甲氧基苯酚含量差异较大，说明使用鲜竹沥质量差异较大。C 公司未检出2，6-二甲氧基苯酚，因鲜竹沥在处方中为原液直接入药，这说明其使用鲜竹沥不含2，6-二甲氧基苯酚，质量存在问题。