基于16S rDNA 分析湖北半夏内生菌群结构及代谢功能

王帆帆，唐 涛，郭 杰，段媛媛，郭晓亮，游景茂

（湖北省农业科学院中药材研究所，湖北 恩施 445000）

半夏（Pinellia ternata）为天南星科多年生草本植物，以水玉、地文之名始载于《神农本草经》，是中国著名的中药材，具有镇咳化痰、消肿排脓、燥湿降逆等多种功效，被广泛应用于定咳喘胶囊、通络软坚青和复方半夏片各类药剂产品中［1，2］。目前半夏主产于湖北、重庆、甘肃、安徽、四川等地，湖北优质半夏种植面积约2 000 hm2，每667 m2收入超过2 万元，已成为湖北省江汉平原重点脱贫项目和乡村建设主打产业，其荆半夏因粉性足、颗粒均匀等优势，近年来已逐渐成为半夏种源核心产区，可占国内种子来源的26%以上。2019 年7 月，潜半夏入围湖北省“一县一品”优势品种，成为省地标产品。但人工种植的半夏病虫害突发率较高，部分系统性病害由于缺乏研究，呈加重态势，且人工种植半夏品种活性成分不足，因此需要采取科学途径提高其产量和质量，以维持半夏产业的可持续发展［3］。

研究表明，植物内生细菌广泛存在于植物中且种类繁多，在与寄主的长期进化过程中，不仅对健康植株不造成实质性危害，同时可以促进其生长，提高植物抗逆性，防治病虫害［4］。学者已经从白术、中华补血草、椰枣树等药用植物中分离到Bacillus endophyticusAMR83、Staphylococcus和Streptomyces多 种有益内生细菌［5-7］。有利于植物健康和生长的内生细菌为植物促生细菌，可通过产生生长素、酶物质及固氮途径、解磷作用等途径直接或间接促进植物生长［8］。植物促生细菌是具有改善植物品质、提高抗逆性和防治病虫害等优势的天然资源菌。关于贵州、江苏等地半夏内生细菌多样性分析已有报道，但湖北半夏内生细菌多样性的详细研究尚未报道。

本研究通过高通量测序技术，研究了湖北半夏内生细菌的多样性及其代谢通路，进一步揭示了药用植物半夏内生细菌的分布情况。不仅为湖北半夏与其内生细菌之间相互关系的探索奠定基础，还为提高药用植物半夏的产量和质量提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

试验所选用的植物样品采自湖北省天门市汪场镇湖北省农业科学院中药材研究所半夏基地，采集健康的、长势良好的半夏植株，取其块茎，无菌水冲洗干净后，快速风干，无菌条件下去除块茎表皮，置于液氮中保存待用。

1.2 DNA 提取和PCR 扩增

对获得的半夏块茎样品用Omega E.Z.N.A.®Soil DNA Kit 提取试剂盒提取其微生物组总DNA。使用上游引物为338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCA），下游引物为806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT），对16S rDNA V3～V4 保守区基因片段进行PCR 扩增，扩增产物回收纯化后进行荧光定量分析。

1.3 高通量测序分析

采用Illumina公司的TruSeqNano DNA LT Library Prep Kit 制备测序文库，MiSeq 测序仪进行高通量测序，测序委托派森诺生物科技有限公司完成。

1.4 生物信息学分析

使用QIIME 软件，分别获取样品在门、纲、目、科、属5 个分类水平上的组成和丰度分布表。使用GraPhlAn 工具［9］对样品总体在各分类水平的组成构建等级树。使用PICRUSt 工具［10］进行菌群代谢功能预测。

2 结果与分析

2.1 测序结果质量分析

湖北半夏样品中提取的微生物组总DNA 经PCR 扩增后进行产物回收纯化，回收产物荧光定量后高通量测序，对原始双端序列进行质量筛选，获得样品的有效序列共39 537 条，去除宿主序列64 条。内生细菌序列长度分布在403～466 bp，长度为407 bp的序列最多，有33 868 条，其序列长度分布如图1 所示。从序列长度的分布来看，与16S rDNA V3～V4 区序列长度吻合。

图1 序列长度分布

2.2 细菌多样性分析

使用R 软件将OTU 丰度矩阵文件结果绘制成图2。由图2 可以直观地看到，以97%的序列相似度作为OUT 划分阈值，得到681 个OTUs，其中门、纲、目分类水平的OTU 数均为130，科的OTU 数为129，属的OTU 数为121，种的OTU 数仅为41。稀疏曲线可以评判样品的当前测序深度是否足以反映该群落样本所包含的微生物多样性，如图3 所示。图3 样品曲线趋于平缓，表明该测序结果已足够反映半夏样品所包含的绝大部分微生物，继续增加测序深度已无法检测到大量的尚未发现的新OTU。样品的多样性指数分析表明，chao1 指数和ACE 指数与操作分类单元数相同，均为130，说明测序结果足够反映湖北半夏样品菌群丰度，香浓指数为3.02，辛普森指数仅为0.715，说明该样品菌群多样性较高。

图2 OTU 划分和分类地位鉴定结果统计

图3 OUT 数的稀疏曲线

2.3 细菌群落组成分析

使用R 软件将所得数据绘制成柱状图，以直观地看到样品在同一水平的分类单元数，以颜色区分各分类单元，柱子越长，该分类单元在样品中的相对丰度越高，如图4 所示。半夏内生细菌主要包括6 门10 纲23 目29 科45 属，26 种。半夏的内生细菌主要归类于Proteobacteria 门，占分析总数的97.76%，其次是Actinobacteria门，仅占1.03%。从纲水平来看，该半夏植物的内生细菌的优势菌纲主要是Alphaproteobacteria 和Gammaproteobacteria，所占比例分别是51.65%和46.11%。从目水平来看，该半夏内生细菌主要归类于Rickettsiales 和Pseudomonadales，所占比例分别为49.37%和30.70%。从科水平来看，该半夏内生细菌主要归类于Mitochondria，所占比例为49.37%；其次Pseudomonadaceae 和Burkholderiaceae，所占比例为21.49%和14.74%。与MEGAN 相比，GraPhlAn绘制的分类等级树提供了一种从复杂的群落数据中，快速发现优势微生物类群的方法（图5）。分类等级树展示了样本总体中，从门到属（从内圈到外圈依次排列）所有分类单元（以节点表示）的等级关系，节点大小对应于该分类单元的平均相对丰度，相对丰度前20 位的分类单元还将在图中以字母标识（从门到属按照从外层到内层依次排列），字母上的阴影颜色同对应节点颜色一致。

图4 各水平的群落分类学组成和分布

图5 基于GraPhlAn的样品总体分类等级树

2.4 菌群代谢功能预测

PICRUSt 能将16S rRNA 基因序列在3 种功能谱数据库中进行预测，即KEGG、COG 和Rfam。其中，KEGG 数据库的核心为生物代谢通路分析数据库（KEGG PATHWAY Database，http：//www.genome.jp/kegg/pathway.html），将代谢通路归为6 大类，包括代谢（Metabolism）、遗传信息处理（Genetic Information Processing）、环境信息处理（Environmental Information Processing）、细胞进程（Cellular Processes）、生物体系统（Organismal Systems）和人类疾病（Human Diseases），每一类代谢通路又被进一步划分为多个等级。如图6 所示，代谢功能类群中，能量代谢功能类群在半夏样品中的相对丰度最高，其次是碳水化合物代谢功能和氨基酸代谢功能类群；遗传信息处理功能类群中，复制和修复功能类群的丰度最高；环境信息处理功能类群中，膜运输功能类群的丰度最高；细胞进程功能类群中，细胞运动功能类群的丰度最高；生物系统功能类群中，内分泌系统功能类群的丰度最高；人类疾病功能类群中，传染性疾病功能类群的丰度最高。

图6 PICRUSt预测的KEGG 第二等级分布

3 小结与讨论

2018 年公布的《古代经典名方目录》中，半夏的药方占首批经典名方总数的17%，是重要的传统大宗药材，广泛分布于中国长江流域以及东北、华北等地区［11］。张洁等［12］通过对贵州半夏内生细菌的研究，表明其内生细菌主要归属于微杆菌属、寡养单胞菌属、类芽孢杆菌属、芽孢杆菌属。张盼盼［13］通过对江苏邳半夏内生细菌的多样性分析，表明其内生细菌主要分布于Actinobacteria、Proteobacteria、Tenericutes、Firmicutes、Bacteroidetes、Cyanobacteria 6个门。刘建玲等［14］对陕西杨凌半夏内生菌的分离鉴定结果表明，其优势种群为棒孢霉属、青霉属和镰孢霉属。本研究通过对湖北半夏内生细菌多样性分析表明，该半夏样品的优势菌群主要归于6 门、10纲、23 目、29 科、45 属、26 种。在门水平上丰度最高的是Proteobacteria，在科水平上丰度较高的是Mitochondria、Pseudomonadaceae、Burkholderiaceae。由此可知，不同地区的半夏内生细菌多样性各有差异，这可能与地方性土壤、气候、温度等环境条件和栽培方式有关。通过本研究可初步明确湖北半夏内生细菌的多样性。

目前关于药用植物内生细菌代谢功能与寄主健康生长等相关的研究较为热门。内生细菌可通过产生植物生长素、酶等功能直接促进植物生长，同时可通过产生细胞壁裂解酶等物质减少病菌的侵入，间接促进植物生长。周佳宇等［15］从茅苍术中分离到可产生IAA的内生细菌，Qin 等［16］从中华补血草中分离到产ACC 脱氨酶的内生细菌，均可促进植物的生长。本研究对湖北半夏内生细菌的基因功能和代谢途径进行初步分析，结果表明代谢功能类群中的能量代谢功能类群在半夏样品中的相对丰度最高，其次是碳水化合物代谢功能和氨基酸代谢功能类群，为今后研究半夏内生细菌代谢产物多样性和生防菌的开发提供理论基础。

半夏有效成分之一是生物碱类物质，目前已从半夏中分离出麻黄碱、葫芦巴碱、肌苷等多种生物碱类物质。部分内生细菌在与寄主长期的进化过程中彼此相互影响，具有相似的次生代谢产物，提高寄主活性成分。苏昊［17］从半夏体内得到多株产生物碱类的内生菌。刘建玲等［18］研究表明半夏内生细菌不仅诱导其生物碱的合成，同时可产生某些相同的生物碱。故本研究的下一步工作将对湖北半夏内生细菌代谢产物多样性及功能进行研究，明确其作用机制，为提高半夏质量及产量提供有力支持。