新型口腔细菌丝氨酸蛋白酶抑制剂Tannerpin的制备与结晶

杨婷婷，许佳伟，周爱武，叶 玮

1.上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔预防科，上海交通大学口腔医学院，国家口腔医学中心，国家口腔疾病临床医学研究中心，上海市口腔医学重点实验室，上海 200011；2.遵义医科大学珠海校区，珠海 519040；3.上海交通大学医学院病理生理学系，上海 200025

丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor，Serpin）是一类具有相似三维空间结构的蛋白酶抑制剂，广泛存在于各种生命物种中，包括动物、植物、真菌、细菌、古生菌以及一些病毒［1］。缩写词Serpin是基于首先发现的该类蛋白具有抑制胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶活性而得名［2］。研究［3-4］显示，多数Serpin由350～400个氨基酸组成，且该家族成员之间的序列同源性不高（大约为25%）。典型的Serpin由蛋白主体和反应中心环（reactive center loop，RCL）组成。其中，蛋白主体结构具有高度保守性，通常包括3个β折叠（A、B、C）和8～9个α螺旋（hA～hI）［5］；RCL包含了能被靶蛋白酶的底物结合位点识别的氨基酸（即活性中心P1）［6］，该氨基酸为Serpin的抑制专一性位点，如位点发生突变则可能会导致疾病的发生［7］。Serpin可分为抑制型和非抑制型［8］。大多数的Serpin家族成员具有抑制活性［9］，以独特的“自杀式底物”的方式［即其构象由严紧型（S型）转变成松弛型（R型）］调节蛋白酶的功能，从而使蛋白酶失活［10］；另一部分Serpin成员则可行使非抑制功能，如血液凝集、炎症反应［4］、激素合成和转运［11］、分子伴侣［12］及肿瘤抑制［13］等。

在人体内，除自身基因编码的36个Serpin外，众多寄生菌也可分泌多种Serpin。研究［14］显示，Serpin在体内的各种病理生理过程中可能扮演了重要角色，其中有关细菌分泌的Serpin的研究相对较少。直到2002年，Serpin可由原核生物分泌才得到首次证实［15］，且仅针对少数几个人体寄生菌分泌的Serpin进行了研究［16］。Miropin是第一个被研究的由人体寄生菌［牙周病相关病原体福氏单胞菌（Tannerella forsythia，Tf）］分泌的丝氨酸蛋白酶抑制剂，能够有效抑制多种丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶，可能参与了牙周炎的发生与发展［16-17］。

研究［18-19］显示，口腔微生物菌落是仅次于肠道微生物菌落的第二大人类相关微生物群落，目前包括了超过600个的物种或种系型（http：//www.homd.org）。牙周病是一种广泛存在的多因素慢性炎症性疾病，困扰了全球约20%的人群［20-21］。Tf是一种专性寄生在牙周袋内的细菌［22］，且已有不少针对该病原菌的相关报道。Dewhirst等［23］发现了牙周内的其他相关菌，如Tannerellasp.BU045（又称HOT 808）；且该菌所寄生的牙周袋内的丝氨酸蛋白酶活性较为异常［24］。我们通过基因组序列分析及氨基酸序列对比发现，该病原体可能分泌了一个新型Serpin，而其是否具有蛋白酶抑制活性尚未可知。基于此，本研究构建了融合表达载体pSUMO3-新型Serpin，通过原核细胞表达系统制备高纯度的新型Serpin，并对其进行蛋白结晶条件的筛选及作用底物的初筛，以期为后续的结构和功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与质粒 大肠埃希菌感受态细胞BL21（DE3）、pSUMO3载体由本实验室保存并提供。本研究所用的pSUMO3载体经实验室优化，删去了小分子泛素相关修饰物蛋白（small ubiquitin-related modifier protein，SUMO）标签中最后1个甘氨酸（包括）至BamHⅠ酶切位点前的一段碱基序列，即当融合蛋白被SUMO特异性蛋白酶2（SUMO-specific protease 2，SENP2）酶切后，目的蛋白的N端仅残留1个丝氨酸残基，以减少过多残留氨基酸对蛋白质的结晶和结构解析的影响。

1.1.2 试剂与仪器 氨苄青霉素［生工生物工程（上海）股份有限公司］，IPTG（Isopropyl β-D-Thiogalactoside）（上海麦约尔生物技术有限公司），十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）（Invitrogen，美国），2×YT培养基（Oxoid，英国）。实验室自制：buffer A［20 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH=7.5），含500 mmol/L NaCl和20mmol/L咪唑］，buffer B［20mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH=7.5），含500mmol/L NaCl和300mmol/L咪唑］。蛋白质层析系统ÄKTA Prime Plus system、HisTrap HP预装柱（GE healthcare，美国），NanoDrop8000分光光度计（Thermo Scientific，美国），低温超速离心机（Eppendorf，德国），高压细胞破碎机［永联生物科技（上海）有限公司］，96孔坐滴结晶板（Hampton Research，美国）。

1.2 方法

1.2.1 新型Serpin的筛选与融合表达载体的构建 通过分析口腔牙周疾病相关菌Tannerellasp.BU045基因组序列，并利用经典的Serpin超家族成员α1-抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，α1-AT，PDB：1QLP）和Miropin的氨基酸序列进行对比，筛选出由该菌分泌的新型Serpin。而后，将获得的Serpin基因序列交由苏州金唯智生物科技有限公司进行全基因技术合成及密码子优化，同时委托其完成融合表达载体的构建。

1.2.2 融合蛋白的诱导表达及验证将“1.2.1 ”中构建好的融合表达载体（pSUMO3-新型Serpin）转化至BL21（DE3）中，随后涂布至含氨苄青霉素（ampicillin，Amp）的LB平板上，37℃倒置培养过夜。次日，挑选单菌落至含Amp的2×YT液体培养基中，37℃摇床培养过夜。以1∶100的比例将过夜菌液接种至含Amp的2×YT培养基中，37℃摇床培养2 h。当菌液在600 nm波长处的吸光度值达0.6 时，将摇床温度降至25℃并加入IPTG诱导表达过夜，而后于4℃、10 000×g离心15min，收集菌体备用。分别于诱导前、诱导后7 h和24 h留取菌液样品，采用SDS-PAGE对融合蛋白的诱导表达情况进行验证。

1.2.3 融合蛋白的纯化及目的蛋白的收集 将菌体重悬于buffer A中，用高压细胞破碎机进行细菌破碎，而后高速离心菌液1 h，收集上清液并上样至HisTrap HP预装柱，待蛋白样品吸附在层析柱后，经蛋白质层析系统进一步纯化，并调节Buffer B的浓度从0逐渐增加至100%（即通过增加咪唑的浓度，调节蛋白与镍离子的结合程度）对样品进行梯度洗脱，收取每个蛋白峰对应的样品并进行SDS-PAGE验证。将收集到的融合蛋白（SUMO3-新型Serpin）经透析过夜后，向其中加入SENP2，并在4℃下经0.22 μm滤膜透析过夜。将获得的透析液再次上样至HisTrap HP预装柱，去除SUMO融合标签和SENP2，并采用SDS-PAGE对酶切效果进行验证。而后，使用HiLoad 16/60 Superdex 75 pg凝胶过滤柱对目的蛋白进一步纯化，并经SDS-PAGE分析验证。最终，将目的蛋白浓缩、换液，保存于-80℃。

1.2.4 新型Serpin结晶条件的筛选、优化和晶体衍射采用坐滴式气相扩散法对新型Serpin的结晶条件进行初筛，即使用自动化移液站将Hampton Research结晶筛选试剂盒分装至96孔坐滴结晶板里，由自动化结晶机器人在该结晶板上完成对蛋白晶体生长条件的筛选。针对初筛结果，选取其中生长状态较好的晶体，在24孔晶体生长板上进行手动优化，即通过调整沉淀剂种类及浓度、新型Serpin浓度、结晶温度以及pH值等，获得高质量蛋白晶体。将筛选得到的晶型较好的晶体取出后用液氮速冻备用，于上海同步辐射光源（Shanghai synchrotron radiation facility，SSRF）的生物大分子晶体学光束线/实验站（BL17U）收集晶体X射线衍射数据。

1.2.5 新型Serpin作用底物的初步筛选 于室温下，将纯化后的新型Serpin与作用底物按照质量比为1∶1混匀，37℃孵育30m in。而后，采用SDS-PAGE对上述混合液进行检测。本次新型Serpin作用底物的初筛范围主要为本实验室常用的蛋白酶，包括人凝血因子Ⅱ a（coagulation factor Ⅱ a，F Ⅱ a）、FⅨa、FⅪa、抗凝蛋白C（protein C，PC）、组织型纤溶酶原激活剂（tissueplasminogen activator，t-PA）、人白细胞弹性蛋白酶（human leukocyte elastase，HLE）、人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶（elastase）、胰蛋白酶（trypsin）、激肽释放酶1（Kallikrein 1，KLK1）、KLK7、蛋白酶3（proteinase 3，PR3）、组织蛋白酶B（cathepsin B，CB）、组织蛋白酶G（cathepsin G，CG）。

2 结果

2.1 新型Serpin的筛选及融合表达载体的构建

经基因组序列分析及氨基酸序列比对，本研究筛选得到了口腔牙周疾病相关菌Tannerellasp.BU045分泌的Serpin，我们将其命名为Tannerpin；氨基酸序列比对结果（图1）显示，α1-AT、Miropin和Tannerpin的RCL氨基酸序列相对保守，但活性中心有所不同，即α1-AT的活性中心是甲硫氨酸（Met，M）、Miropin是苏氨酸（Thr，T）、Tannerpin则是少见的丙氨酸（A la，A）。随后，我们以Tannerpin基因序列构建融合表达载体pSUMO3-Tannerpin，图谱如图2所示。

2.2 融合蛋白的诱导表达、纯化及目的蛋白的获取

BL21经融合表达载体pSUMO3-Tannerpin转化后，分别于诱导前、诱导后（7 h和24 h）裂解细胞，用SDSPAGE检测细菌总蛋白和上清液中可溶蛋白的表达。结果（图3A）显示，与诱导前相比，诱导后（7 h和24 h）的细菌总蛋白中出现了1条相对分子质量约为58 000的特异性条带，与融合蛋白的理论分子量相符，同时其上清液中也出现了少量可溶的融合蛋白；且随着诱导表达时间的延长（从7 h到24 h），融合蛋白的表达量有明显增加。

随后，经蛋白质层析系统进一步纯化、洗脱后，SDS-PAGE的检测结果（图3B）显示，经过HisTrap HP预装柱后，上清液中相对分子质量58 000附近的蛋白条带消失了，而在后续的洗脱液中又见该蛋白条带；继而说明，洗脱下来的蛋白即为结合在HisTrap HP预装柱上的SUMO3-Tannerpin。经SENP2酶切后再次经过HisTrap HP预装柱，用SDS-PAGE进行检测，结果（图3C）显示，融合蛋白被酶切出2条蛋白条带，相对分子质量分别在43 000和15 000附近（SUMO的相对分子质量约15 000），而经过HisTrap HP预装柱的蛋白条带在43 000附近，与Tannerpin的理论分子量相符，继而说明该蛋白即为已去除SUMO标签的Tannerpin。采用HiLoad 16/60 Superdex 75 pg凝胶过滤柱对第二次过HisTrap HP预装柱的透析液进行纯化并行SDS-PAGE检测，发现在相对分子质量43 000附近有均一的蛋白条带，即为Tannerpin。

图3 融合蛋白（SUMO3-Tannerpin）的诱导表达、纯化及验证Fig 3 Induced expression,purification and validation of fusion protein(SUMO3-Tannerpin)

2.3 Tannerpin结晶条件的筛选、优化和晶体衍射结果

首先，我们尝试在20℃、20%聚乙二醇8000、0.1mol/LTris（pH=8.5）、0.2mol/LM gCl2条件下对Tannerpin进行结晶，得到了小的、片状、针状及不规则状的晶体（图4A）。在此初筛基础上，我们对晶体条件进行优化，即在20℃、Tannerpin浓度为15 mg/m L、结晶pH=6.0、沉淀剂为28%聚乙二醇3350和8%Tacsimate条件下，获得了更大、形状更好的蛋白晶体（图4B）。随后，对优化的状态较好的Tannerpin晶体进行X射线衍射分析，结果（图4C）显示该晶体的分辨率为1.7 Å（1Å=10-10m）。

图4 Tannerpin蛋白结晶条件的筛选、优化及晶体X射线衍射Fig 4 Screening and optimization of crystallization conditions of Tannerpin protein and its crystal X-ray diffraction

2.4 Tannerpin作用底物的初步筛选

SDS-PAGE检测结果（图5）显示，泳道4（HLE）、5（elastase）、12（trypsin）蛋 白 酶 将Tannnerpin作 为了水解底物，即在相对分子质量43 000附近的Tannerpin因被上述3个靶酶消耗而减少，出现了蛋白条带下移。

图5 Tannerpin作用底物的初步筛选结果Fig 5 Preliminary screening results of Tannerpin substrates

3 讨论

众所周知，Serpin在生物体内发挥着重要且广泛的病理生理作用，其功能障碍与多种疾病相关。目前，有关人体编码Serpin的结构与功能的报道较多。例如，在炎性肠道疾病中α1-AT的表达水平会发生改变，而在给炎性肠道疾病小鼠使用Serpin后，其炎症得到有效抑制，组织损伤有所减轻［25］；相关临床数据表明，在肥胖及2型糖尿病患者的脂肪组织中，Vaspin大量表达［26］；有研究［27］证实，非抑制型丝氨酸蛋白酶抑制剂Maspin与乳腺癌和前列腺癌高度相关，可以帮助推测患者的预后情况。细菌在人体健康中扮演了非常重要的角色，通过参与多种病理生理过程发挥维持稳态、调节免疫等作用［28］。例如，具核梭杆菌（Fusobacterium，Fn）在结直肠癌组织中富集，能够通过TIGIT（T-cell immunoglobulin and ITIM domain）抑制T细胞和自然杀伤细胞（natural killer cell，NK cell，NK细胞）的抗肿瘤作用，帮助癌细胞进行免疫逃逸，从而促进结直肠癌的发展［29］；相关动物实验证明，清除肠道中的Fn可以抑制肿瘤生长，并有助于恢复肿瘤小鼠对化学治疗药物的敏感性［30］。

虽然在人体内存在大量的Serpin，但其中仅有36个Serpin是由人的基因组编码，其余大部分则是由肠道菌群和口腔菌群分泌，且鲜少有关于这些细菌的Serpin的研究［5］。牙周致病菌Tf分泌的Miropin具有广泛的抑制活性，能够有效抑制多种丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶，推测该菌在牙周病的致病过程中可发挥毒力作用［16］。本研究通过比对口腔牙周疾病相关菌Tannerellasp.BU045的基因组序列及Serpin超家族成员α1-AT、Miropin的氨基酸序列，筛选到该菌分泌的一种新型Serpin，即为Tannerpin；同时还发现，α1-AT、Miropin和Tannerpin的RCL氨基酸序列均相对保守，但活性中心有所不同，其中Tannerpin是以少见的丙氨酸作为其活性中心。在大肠埃希菌BL21（DE3）原核表达系统中成功表达融合蛋白SUMO3-Tannerpin，经纯化、酶切、验证后得到目的蛋白Tannerpin，再经对该抑制剂结晶条件的初筛及优化，最后在Tannerpin浓度为15mg/m L、结晶pH=6.0、沉淀剂浓度为28%聚乙二醇3350和8%Tacsimate的条件下，获得了分辨率为1.7 Å的Tannerpin晶体。在Tannerpin作用底物的初筛实验中，我们发现其并不能有效抑制一些常见的丝氨酸蛋白酶如HLE、elastase和trypsin，而是作为它们的水解底物被分解［即当Tannerpin与上述底物发生反应时，其RCL插入A-β折叠片层中的速度较慢，使Tannerpin与靶酶形成的共价结合在靶酶失活前被破坏，因此Tannerpin则会作为靶酶的水解底物被消耗，一般表现为其RCL被切断（多发生在P1位点）］，这可能是由于底物筛选范围（仅来自于本实验室）较窄所致。后续，我们将扩大筛选范围来寻找Tannerpin的作用底物，同时解析其三维空间结构，对其作用机制与功能进行更深入的探索。

参·考·文·献

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