miR-146a通过靶向调控Notch1抑制晶状体上皮细胞间质转化作用

刘文兰，王莉，杨扬，闫瑾，朱丹，李怡琛

(西安医学院医学技术学院，陕西 西安 710021)

白内障指眼部晶状体混浊，是世界上致盲的主要因素，占所有致盲病例的47.8%[1-3]。囊外晶状体纤维摘除和人工晶状体植入等手术是治疗白内障的主要手段[4-5]。然而，白内障手术后可能导致继发性晶状体混浊，也称为后囊膜混浊(posterior capsule opacification，PCO)，是术后最常见的并发症[6-8]。术后残留在前囊膜周边部和赤道部的晶状体上皮细胞(lens epithelial cells，LECs)增殖并迁移到后囊，并且进行上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是PCO发展中的一个关键过程[9-10]。LECs在EMT过程中失去上皮细胞的特征，包括上皮细胞的标志物E钙粘蛋白(E-cadherin)的下调和间质标记物如α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)水平上升，从而获得间充质特性，并合成细胞外基质[11]。因此，抑制EMT是治疗PCO的关键环节。目前，microRNAs参与调节多种生理和病理过程已被学界普遍认同[12]。此外，最近的证据[13]表明，许多miRNA在晶状体发育和白内障发生中发挥着重要作用。据报道[14-15]，MicroRNA-146a(miR-146a)是许多肿瘤包括胃癌、前列腺癌和乳腺癌的已知肿瘤抑制因子，并参与调节细胞增殖、迁移、凋亡和EMT等多种细胞生理和代谢机制。本研究拟探讨miR-146a在调节LEC细胞EMT中的关键作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器设备

HLE-B3购自上海赛百慷公司；Dulbecco’s改良鹰培养基(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)培养基(Gibco，USA)、miR-146a的模拟物(miR-146a mimics)和阴性对照模拟物(miR-NC)均购自上海生工生物有限公司；转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、总核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)提取试剂盒(Tiangen，Beijing)、M-MLV逆转录酶、SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒、实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)扩增产物由上海生工生物设计合成；放射免疫沉淀分析(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解缓冲液(Beyotime，Beijing)、抗Notch1抗体(Abcam公司)、抗α-平滑肌肌动蛋白抗体(美国CST公司)、抗E-钙粘蛋白抗体(美国CST公司)、抗波形蛋白抗体(美国CST公司)、抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的抗体(美国Proteintech)HRP标记二抗(北京Solarbio公司)、DAPI一抗(美国CST公司)、pmirGLO载体(Promega，USA)购自试剂代理公司。

1.2 细胞培养及细胞转染

人晶状体上皮细胞HLE-B3细胞株在10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM培养基、37 °C和5% CO2的MCO-18AC细胞培养箱中培养，待汇合度达到80%左右进行实验。实验分为对照组(Control组)、TGF- β处理组(TGF-β组)、TGF-β处理+miR-NC转染组(TGF-β+miR-NC组)和TGF-β处理+miR164a mimics转染组(TGF-β+miR146a mimics组)。miR-146a mimics序列为5’-CTT TGA GAA CTG AAT TCC ATG GGT TGT GTC AGT GTC AGA CC-3；miR-NC序列为5’-CAG CAG TTC TAT TAG ACT GTG TAT CTA AGC TTT GTT GTC CCT A-3。严格按照产品说明书进行规范操作，以Lipofectamine 2000对TGF-β+miR-NC组和TGF-β+miR14a mimics组的两组HLE-B3细胞分别进行miR-NC和miR-146a mimics的转染，转染4 h后，根据分组需要将两组转染细胞和TGF-β组细胞与含有10 ng/mL TGF-β的HLE-B3细胞孵育48 h。单独TGF-β诱导则以10 ng/mL TGF-β处理HLE-B3细胞48 h，收集细胞进行下一步的检测和分析。

1.3 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)

收集处理的培养细胞，按照说明书操作步骤，以总RNA提取试剂盒提取总RNA，以M-MLV逆转录酶将提取的100 ng 总RNA逆转录为cDNA样本。cDNA第一链的合成按照说明书进行，cDNA扩增的PCR反应程序：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。采用SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒进行RT-qPCR，扩增体系20 μL。扩增条件：95 ℃ 5 min，40个PCR循环(95 ℃ 10 s；55 ℃ 20 s；72 ℃ 34 s)。相关基因的mRNA表达以GAPDH为内参基因，micro-RNA以U6内参基因，读取每个基因的Ct值，以2-ΔΔCt表示基因相对表达量。引物序列如表1所示。

表1 Real-time PCR 引物序列

1.4 Western blot

以含有蛋白酶抑制剂苯甲磺酰氟的RIPA裂解缓冲液对培养的LECs细胞进行细胞裂解物制备，参照既往研究中Western blot的标准流程进行操作[16]，根据BCA 蛋白定量试剂盒定量，然后在SDS-PAGE凝胶凝胶上进行电泳、分离，再转入聚偏氟乙烯[poly(1,1-difluoroethylene)，PVDF]膜上转膜，5%脱脂奶溶液室温封闭2 h，添加一抗：抗Notch1(1∶1 000)、抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA，1∶500)、E-钙粘蛋白(E-cadherin，1∶500)、波形蛋白(1∶500)、抗GAPDH(1∶500)，4 ℃孵育过夜，次日PVDF膜恢复室温后用TBST洗膜3次，每次8 min，分别加入二抗HRP标记二抗(1∶3 000)，室温下孵育1 h，再次用TBST 洗膜3次，每次8 min，最后加电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)显影液显影。GAPDH作为内参，采用Image J软件分析结果。蛋白表达水平以与内参比值的平均灰度表示。

1.5 免疫荧光分析

处理培养后的LECs细胞在室温下依次以4%多聚甲醛固定15 min，用0.1% tritonX-100通透处理30 min，再以1%山羊血清封闭15 min，与相应DAPI一抗(1∶200)以及抗α-SMA抗体(1∶200)4 ℃下孵育过夜，然后与相应的Cy3标记的二级抗体在37 ℃下孵育1 h。以DAPI进行核复染后，用抗荧光淬灭封片剂对细胞进行荧光猝灭，在400倍放大的荧光显微镜下观察细胞。

1.6 双荧光素酶报告基因分析

通过使用TargetScan(http://www.targetscan.org)和miRDB(http://www.mirdb.org)生物信息学数据库检索miR-146a靶向目的基因Notch1的结合位点。在HEK 293 T细胞中构建双荧光素酶基因报告分析。通过PCR扩增Notch1的野生型(WT)3′-UTR序列，并将其克隆到pmirGLO载体中，采用点突变法扩增Notch1突变株(MUT)3′-UTR序列(突变位点位于3′-UTR 序列242-263 region)，并克隆到pmirGLO载体中。使用Lipofectamine 2000试剂将pmirGLO-Notch1-3′-UTR-WT或pmirGLO-Notch1-3′-UTR-MUT与miR-146amimics或miR-NC共转染到293 T细胞中。转染48 h后，按照试剂盒说明书操作流程，通过双荧光素酶报告试剂盒测量相对荧光素酶活性。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 TGF-β诱导的LECs细胞中miR-146a和Notch1表达变化

与正常对照组LECs细胞相比，TGF-β诱导LECs细胞后miR-146a表达水平降低，而Notch1的转录和蛋白表达水平增高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.2 microRNA-146a可抑制TGF-β诱导的LECs细胞EMT

Western blot检测结果表明，TGF-β处理LECs细胞后，促进LECs细胞的间质标志物α-SMA、Vimentin表达上升，而上皮标志物E-cadherin表达下降(P<0.05)；而转染miR-146a mimics后可抑制TGF-β诱导的α-SMA、Vimentin蛋白表达上升，并提升E-cadherin的表达水平(P<0.05)。见图2。免疫荧光法发现，TGF-β诱导α-SMA在LECs细胞中的免疫反应性显著增加，转染miR-146a mimics后可显著逆转TGF-β诱导的EMT反应变化。见图3。TGF-β可诱导LECs细胞的EMT，而miR-146a抑制了TGF-β诱导的LECs细胞EMT。

2.3 miR-146a通过靶向调控Notch1的表达

通过利用TargetScan Human 7.2(http://www.targetscan.org)生物信息学数据库进行检索发现，Notch1 mRNA的3′-UTR序列242-263预测是miR-146a的结合序列，提示Notch1可能是miR-146a的靶基因之一。采用双荧光素酶报告基因进行靶向分析，结果显示：当pmirGLO-Notch1-3′UTR-WT和miR-146a模拟物共转染时，相对荧光素酶活性显著降低(P<0.05)。此外，pmirGLO-Notch1-3′UTR-MUT和miR-146a模拟物共转染不抑制荧光素酶的相对活性，确认miR-146a直接靶向Notch1 mRNA的3′UTR。见图4。

3 讨论

本研究利用TGF-β诱导LECs细胞建立PCO细胞模型，证明TGF-β诱导后LECs细胞发生EMT。早有研究[17]报道，TGF-β、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)等多种细胞因子可触发EMT。且TGF-β被发现在白内障术后的房水中显著升高，活化后的TGF-β对术后残留LECs的增生、迁移和转分化等细胞过程中起着关键性作用，是LECs在各种生理、病理过程中最重要的调节因子之一[18]。Zavadil等[19]报道，TGF-β呈剂量和时间依赖性地诱导LECs细胞通过TGF-β/Smad信号通路的激活，促使LECs细胞的EMT发生。而本研究显示LECs细胞经TGF-β诱导后胞浆中的间质标记物α-SMA显著表达上升，利用Western blot进一步分析细胞蛋白表达水平，结果发现TGF-β诱导后LECs细胞中不仅间质标记物α-SMA、Vimentin表达上升，且上皮标志物E-cadherin显著下降，表明LECs细胞表现出失去细胞极性而向间质纤维化转变，获得间质特征。综合既往研究结果，提示TGF-β在LECs细胞EMT中发挥关键作用，从而参与PCO的发生。

miR-146a通常被认为涉及调控肿瘤细胞的分化、增殖、迁移和凋亡等多种生理过程[20]。但也有越来越多的证据[21]表明，miR-146a参与包括白内障等在内的各种眼部疾病发病和进展机制。有研究[22]显示，miR-146a与血管性眼科疾病有关，在湿性年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)患者的视网膜内皮细胞中miR-146a显著上调，并通过参与调节补体因子H(complement factor H，CFH)介导的炎症影响发挥作用[23]。而Poe等[24]通过整合转录组和蛋白质组分析揭示了miR-146a通过Notch信号在人角膜缘上皮中介导伤口愈合、炎症、干细胞维持和分化等调节作用。而本研究首次发现，miR-146a在TGF-β诱导的LECs细胞中表达下降，而转染miR-146a mimic能明显抑制TGF-β诱导的LECs细胞中EMT相关蛋白的表达，提示miR-146a可能参与白内障术后PCO的发生过程，并且miR-146a通过抑制TGF-β诱导的LECs-EMT来发挥关键作用。

此外，本研究通过双荧光素酶报告基因实验发现，Notch1是miR-146a的靶基因之一。Notch1属于Notch蛋白家族，Notch1蛋白激活可通过介导多种EMT相关基因的表达从而诱导EMT的发生[25]。抑制Notch1激活可减弱TGF-β诱导的EMT，表现为E-cadherin表达减少，而α-SMA、snail等表达增加[26]。Notch信号在PCO发病机制中也起着重要作用。Han等[27]表明，miR-34a通过靶向Notch1能抑制LECs细胞的EMT发生，并且利用Notch1的小分子抑制剂DAPT也可以有效抑制TGFβ诱导后LECs细胞中α-SMA、Vimentin、纤连蛋白(fibronectin，FN)的表达上升，从而减轻LECs细胞中TGFβ诱导的EMT。而本研究发现，当利用TGFβ刺激LECs细胞后，不但miR-146a表达水平下降，且Notch1的转录和表达水平均明显上升，提示miR-146a和 Notch1可能参与TGF-β诱导的LECs-EMT。结合miR-146a可以通过靶向调控Notch1，推测miR-146a抑制TGF-β诱导的LECs-EMT发生，可能是通过靶向调节Notch1的表达水平来实现。

综上所述，miR-146a通过靶向调节Notch1的表达，抑制Notch1信号通路的激活，从而阻断TGF-β诱导的LECs-EMT，为临床预防和治疗白内障术后PCO发生提供了一个新的理论策略途径。