超声造影定量分析大鼠肝缺血再灌注损伤的实验研究
2022-01-07南格利阮欣宇段麦叶
南格利 阮欣宇 王 柳 刘 洁 段麦叶 王 莉 王 欢
肝缺血再灌注损伤(hepatic ischemia-reperfusion injury,HIRI)是指肝脏缺血一段时间后血流再灌注时引发的一系列炎症反应、代谢紊乱、氧自由基生成等造成的肝实质损伤[1-2]。目前临床诊断HIRI 的方法主要有病理检查、MRI 和肝功能检测等,但均有其局限,其中病理检查虽为诊断HIRI的金标准,但其具有创伤性,可能对肝脏造成损伤[3]。因此,寻求一种更为安全、有效的检测方法极为重要。超声造影通过静脉注射造影剂显示病变的血液循环情况,从而评估病情,克服了常规超声对低速血流敏感性差的不足[4]。本实验通过探讨超声造影在大鼠HIRI 病情评估中的应用价值,旨在为临床提供参考依据。
材料与方法
一、实验动物与分组
雄 性 SD 大 鼠 49 只 ,体 质 量 170~210 g,平 均(192.16±10.21)g,购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司[动物合格证号:SCXK(沪)2008-0016]。49 只大鼠中,因麻醉、术中出血过多及未到设定再灌注时间点意外死亡7 只,余42 只采用随机数字表法分为7 组,每组各 6 只,分别为假手术组和 HIRI 0.5 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 6个亚组。
二、实验方法
1.实验动物模型建立:15%水合氯醛(西安天正药用辅料有限公司)腹腔注射麻醉(350 mg/kg)后将大鼠固定于手术台上,腹部至剑突术区备皮消毒,于上腹部正中切口打开腹腔,分离出肝脏左、中叶之肝蒂,使用无创血管夹夹闭肝中叶和左叶处门静脉、肝动脉,阻断血供,止血钳夹闭切口临时关闭腹腔。持续缺血1 h后取出血管夹,再灌注成功后关闭腹腔。假手术组未夹闭门静脉和肝动脉,其余实验方法同上。
2.超声造影检查:使用西门子Acuson S 2000 彩色多普勒超声诊断仪,9L4 线阵探头,频率7~12 MHz;造影剂使用意大利博莱科公司生产的SonoVue,加入5.0 ml 生理盐水稀释后振荡混匀成混悬液备用。常规超声显示肝左叶及腹主动脉切面,然后开启超声造影模式,机械指数0.07,深度、增益等参数在实验过程中保持不变。将0.2 ml超声造影剂混悬液注入大鼠尾静脉,随后注射0.5 ml生理盐水,开启计时器并存储视频90 s。开启对比脉冲序列超声造影后处理软件,脱机处理存储的视频。将感兴趣区(region of interest,ROI)置于肝实质,大小设为5.0~8.0 mm2。软件自动生成超声造影时间-强度曲线(TIC),获取峰值强度(PI)、曲线下面积(AUC)、达峰时间(TP)、平均渡越时间(MTT)等参数。每只大鼠选取3个ROI并重复测量3次取平均值。
3.实验室检查:各组大鼠再灌注后取其下腔静脉血3 ml,置于4℃冰箱保存2 h,3000 r/min 离心15 min,取其上清液于-80℃下保存,应用7600-120 全自动生化分析仪(日本HITACHI 公司)检测谷丙转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平。
4.病理检查:取各组大鼠肝左叶组织标本,10%甲醛液固定后切片,HE 染色后置于CX31 光学显微镜(日本奥林巴斯公司)下观察病理组织学改变。
三、统计学处理
应用SPSS 22.0 统计软件,计量资料以表示,多组比较采用方差分析,两两比较行t检验。相关性分析采用Pearson 相关分析法。P<0.05 为差异有统计学意义。
结 果
一、超声造影检查结果比较
HIRI 0.5 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 组PI、AUC 均低于假手术组,TP、MTT 均高于假手术组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。随着HIRI时间延长,AUC先逐渐降低,于 48 h 时再升高,TP、MTT 先逐渐升高,于48 h时再降低。见表1和图1。
图1 各组超声造影图
表1 各组超声造影定量参数比较()
表1 各组超声造影定量参数比较()
与假手术组比较,*P<0.05。PI:峰值强度;AUC:曲线下面积;TP:达峰时间;MTT:平均渡越时间
PI(dB)22.96±1.54 AUC(dB·s)1065.36±48.47 TP(s)27.83±2.05 MTT(s)37.92±2.14 46.85±2.11*45.36±2.98*49.28±3.06*58.43±4.15*62.89±4.56*47.33±2.58*组别假手术组HIRI组0.5 h 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h 15.35±2.14*16.84±2.39*14.56±2.58*12.12±2.28*9.15±1.84*17.95±2.98*952.28±36.64*910.18±40.36*730.48±45.23*672.84±38.25*581.67±37.55*795.39±53.25*31.75±2.74*33.14±3.18*36.23±3.39*44.08±3.84*48.12±4.06*30.15±2.84*
二、实验室检查结果比较
HIRI 0.5 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 组血清 ALT、AST 水平均高于假手术组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。随着 HIRI 时间延长,ALT、AST 水平先升高后下降,在6 h 时达到峰值。见表2。
表2 各组ALT、AST水平比较() U/L
表2 各组ALT、AST水平比较() U/L
与假手术组比较,*P<0.05。ALT:谷丙转氨酶;AST:天冬氨酸转氨酶
组别假手术组HIRI组0.5 h 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h ALT 18.36±3.68 AST 19.04±3.85 118.62±9.38*209.17±20.49*342.89±24.67*189.63±15.25*99.35±12.78*80.19±9.52*122.44±10.72*209.56±16.64*248.35±23.51*156.29±14.33*100.64±12.43*75.35±8.62*
三、病理检查结果
假手术组肝小叶结构清晰完整,肝细胞无变性坏死,排列整齐,大小均匀,无中心粒细胞聚集。HIRI 0.5 h 组肝细胞水肿变性,肝窦可见大量红细胞淤积;HIRI 3 h 组肝细胞水肿变性,肝窦可见红细胞淤积,并可见少量中性粒细胞;HIRI 6 h、12 h 组肝小叶结构逐渐发生变化,肝细胞水肿变性,逐渐出现灶性坏死,肝窦可见红细胞淤积减少,中性粒细胞增多;HIRI 24 h组肝小叶结构紊乱,较12 h 肝细胞水肿变性减轻,中性粒细胞增多;HIRI 48 h 组较24 h 组肝细胞水肿变性减轻,中性粒细胞减少。见图2。
图2 各组病理图
四、相关性分析
Pearson相关性分析显示,AUC与血清ALT、AST水平均呈负相关(r=-0.754、-0.808,均P<0.001);TP与血清ALT、AST水平均呈正相关(r=0.731、0.709,均P<0.001);MTT 与血清AST 水平呈正相关(r=0.718,P<0.001);PI与血清ALT、AST水平无相关性。见表3。
表3 超声造影定量参数与血清ALT、AST水平的相关性分析
讨 论
HIRI 是由多细胞、多介质联合作用产生的级联反应,其对机体的损伤程度远大于机体的自我保护系统,可导致肝功能衰竭,甚至其他器官功能衰竭,严重危害患者身体健康[5]。因此,如何准确、快速诊断其病情并及时给予治疗极为重要。目前临床诊断HIRI 的方法主要有病理、MRI 和肝功能指标检测等。其中病理检查是诊断HIRI 的金标准,但其有创,极易对患者肝脏造成损伤。MRI 虽能够明确肝功能的病变性质,提供准确的影像学检查资料,但费用高,且无法实现动态监测。肝功能指标检测能实时监测患者的肝功能损伤程度,但无法提供影像学信息。超声造影通过静脉注射造影剂,造影剂再经肺循环到达各组织的微循环,显示病变的血液循环情况,可对肝内微循环进行无创、可重复性检查,能用于定性诊断肝脏肿瘤、评估肝射频消融疗效等。
本实验结果显示,HIRI 0.5 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 组 PI、AUC 均低于假手术组,TP、MTT 均高于假手术组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结合病理检查结果分析原因为:再灌注0.5 h后肝细胞肿胀导致肝血窦变窄,肝窦内红细胞淤积导致肝窦中无复流,使肝血窦内阻力升高,肝缺血后再灌注缓慢。再灌注3 h后,出现少量中性粒细胞,改善了微循环障碍的通透性,有利于降低肝血窦内阻力,再灌注血流流速增快,灌注量增加。再灌注6~24 h 后,肝细胞水肿加重导致肝窦狭窄,中性粒聚集增多阻塞了肝血窦,导致微循环障碍更严重,影响再灌注。再灌注48 h 后,肝组织结构自我修复能力开始发挥作用,机体代偿逐渐趋于平衡,微循环障碍逐渐得到改善[6-7]。另外,本实验结果显示,HIRI 0.5 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 组ALT、AST 水平均高于假手术组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。说明HIRI时肝细胞萎缩、坏死,严重影响其肝功能情况,与左嘉玮等[8]研究结果相似。本实验结果显示,随着HIRI 时间延长,血清ALT、AST 水平先升高后下降,于6 h时达到峰值。分析原因为:HIRI的发生表明其微循环已发生改变,使得炎症因子通过血液循环释放于肝脏,导致肝脏进一步受损,此时血清ALT、AST 水平逐渐升高,且于 6 h 时达到峰值[9];随着HIRI时间的延长,肝功能逐渐恢复,微循环得以改善,故血清ALT、AST水平呈下降趋势。
本实验Pearson 相关分析显示,AUC 与血清ALT、AST水平均呈负相关(r=-0.754、-0.808,均P<0.001);TP 与血 清 ALT、AST 水 平 均呈 正 相 关(r=0.731、0.709,均P<0.001);MTT 与血清AST 水平呈正相关(r=0.718,P<0.001)。说明AUC、TP、MTT均能反映肝功能的变化情况,与王双龙等[10]研究结果相似。
综上所述,超声造影能实时、准确地评估大鼠HIRI微循环的变化,对评估HIRI的病情具有一定价值。但本实验仅比较了HIRI 不同时间点超声定量参数和实验室检查结果,今后需进一步探讨随HIRI时间延长微循环的具体变化。