芥子碱对肝癌细胞增殖、凋亡的影响及机制研究①

高 远 李 冀 韩东卫（黑龙江中医药大学基础医学院，哈尔滨 150040）

肝癌是消化系统常见的恶性肿瘤，也是主要的致死性恶性肿瘤之一。根据组织病理学特征，肝癌可分为：肝细胞癌、肝内胆管癌以及混合型肝癌等类型，其中肝细胞癌最为常见，占肝癌总数的90%以上［1］。流行病学调查显示，2018 年全球范围内肝癌发病人数占恶性肿瘤发病总数的4.7%，死亡人数占肿瘤致死的8.2%，我国肝癌新发患者占全球肝癌新发患者的45%，同时，因肝癌致死的患者占全球的43%，且其发病人数和死亡人数还在逐年增加［2-3］。目前临床上对于肝癌患者主要采取手术、介入、放疗、化疗及分子靶向治疗等手段。早期患者以手术治疗为主，但肝癌发病隐匿、进展快，同时又缺乏早期诊断手段，大部分患者确诊时已经处于中晚期，失去手术治疗机会，化疗和分子靶向治疗是其主要治疗手段，而化疗药在杀伤肿瘤细胞的同时，会不可避免地损伤正常细胞，且长期使用化疗会使肿瘤细胞出现耐药性，导致药效降低［4-5］。因此，探寻低毒、有效的化疗药物或辅助药物降低化疗药物毒性、提高药效是当前临床医生关注的重点。

芥子碱（sinapine）是一种季铵盐生物碱，广泛存在于油菜、芥菜等十字花科植物中，既往研究表明，芥子碱具有一定的抗肿瘤作用，但其在肝癌中的作用报道较少［6-8］。本研究通过细胞实验和裸鼠皮下荷瘤动物实验，借助高通量测序等手段，初步探究芥子碱抗肝癌作用及其可能的作用机制，为后续进行化疗药物增敏实验及临床上作为肝癌患者的辅助性治疗药物提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞来源 HepG2 人肝癌细胞系和LO2 人正常肝细胞系购自中国科学院上海细胞库。

1.1.2 主要试剂与仪器 DMEM 培养基购自美国Gibco 公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；胰蛋白酶和1%青、链霉素双抗购自武汉赛维尔生物科技公司；芥子碱购自上海源叶生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）和细胞凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；抗p53（#2527）、p21（#2947）、GAPDH（#5174）、Bax（#5023）和Bcl-2（#4223）单克隆抗体均购自美国CST公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HepG2 人肝癌细胞和LO2 人正常肝细胞用DMEM 完全培养基，置于二氧化碳培养箱中（37℃、5%CO2）常规培养，隔天换液，待培养瓶中细胞汇合度达90%后铺板进行后续实验。

1.2.2 细胞活力检测 将HepG2 细胞按照1×104个/孔均匀接种于96 孔板，待细胞贴壁后，用不同浓度的芥子碱（0、25、50、100、200 和500 μmol/L）处理24 h 和48 h。在相应时间点，加入10 μl CCK-8试剂，空白组中加入100 μl 含10%CCK-8 试剂的培养基，37℃避光孵育1 h 后，检测各孔吸光度值（A450）。细胞活力（%）=（实验组吸光度值-空白组吸光度值）/（对照组吸光度值-空白组吸光度值）×100%。

1.2.3 细胞凋亡率检测 将HepG2 细胞均匀接种于6 孔板，待细胞汇合度达60%～70%后，换液并加入含有芥子碱的培养基，调整各孔中芥子碱浓度依次为0、25、50、100 μmol/L，24 h后收集细胞（保留上清液中的细胞），用500 μl结合缓冲液重悬后依次加入5μl Annexin V/FITC 和5 μl PI，室温下避光孵育20 min，随即用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.2.4 Western blot 用芥子碱（0、50 μmol/L）处理HepG2 细胞24 h 后，RIPA 提取总蛋白，BCA 法常规定量后调整蛋白浓度为2 μg/μl，取20 μg 总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，常规转膜、封闭后，将PVDF 膜置于相应一抗（稀释比为1∶1 000）中在4℃冰箱孵育过夜，用辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h后，ECL试剂盒显影，随后进行曝光分析。

1.2.5 RNA-Seq 测序分析 收集50 μmol/L 芥子碱处理24 h后的肝癌细胞和对照组细胞，采用Trizol法提取总RNA，由深圳华大基因科技服务有限公司进行RNA-Seq 测序分析，使用R 软件进行差异基因筛选，认为符合|log2Fold Change|＞1 且P-value＜0.05的基因为差异基因，使用GSEA 4.0.4软件进行基因集富集分析。

1.2.6 裸鼠成瘤实验 新购裸鼠待适应环境后，随机分为对照组和实验组。将HepG2 细胞接种在裸鼠背部皮下，接种量约为5×106个/只，接种后隔天观察，1 周后开始腹腔注射，实验组裸鼠注射芥子碱（2 mg/kg），对照组裸鼠注射同等体积的DMSO。每隔3 d 用卡尺测量皮下肿瘤的长、短径，4 周后处死裸鼠，瘤体组织液氮冻存用于后续实验。皮下瘤的体积=瘤体长径×瘤体短径2/2。

1.3 统计学分析 应用SPSS20.0 软件和R3.6.1软件进行数据分析，两组或多组间比较使用t检验或方差分析。P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 芥子碱对肝癌HepG2 细胞活力的影响 随着芥子碱药物浓度的增加和作用时间的延长，HepG2细胞活力显著降低；芥子碱对LO2 细胞活力影响较小，表明芥子碱能时间和浓度依赖地抑制HepG2 细胞活力。见图1。

图1 芥子碱对LO2和HepG2细胞活力的影响Fig.1 Effect of sinapine on cell viability of LO2 and HepG2 cells

2.2 芥子碱对肝癌HepG2 细胞凋亡的影响 采用PI和Annexin V/FITC荧光染料结合流式细胞术检测芥子碱对肝癌HepG2 细胞凋亡的影响。结果表明，芥子碱能诱导HepG2 细胞凋亡，且随着芥子碱药物浓度的增加，细胞凋亡率显著提高。见图2。

图2 芥子碱诱导HepG2细胞凋亡Fig.2 Sinapine induced apoptosis of HepG2 cells

2.3 芥子碱对肝癌HepG2 细胞p53 信号通路的影响 芥子碱处理后，HepG2 细胞中有869 个基因表达水平发生改变，其中334 个基因表达水平上调，535 个基因表达水平下调（图3A）；对基因表达矩阵进行基因集富集分析发现，p53 信号通路显著富集（图3B、C）。因此，本研究进一步检测芥子碱（50 μmol/L）对HepG2 细胞中p53、p21 及其下游凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2 蛋白表达水平的影响。Western blot 结果表明，芥子碱处理后，HepG2 细胞中p53、p21 及Bax 蛋白水平显著增加，Bcl-2 蛋白水平显著降低（图3D、E）。

图3 芥子碱对肝癌HepG2细胞p53信号通路的影响Fig.3 Effect of sinapine on p53 signal pathway of HepG2 cells

2.4 敲低p53 基因阻遏芥子碱对细胞活力和凋亡的影响 为进一步验证p53信号通路在芥子碱影响HepG2 细胞活力和凋亡中的作用，本研究设计p53特异性siRNA，由图4 可知，p53 特异性siRNA 能显著敲低p53 蛋白水平（图4A、B）。CCK-8 结果表明，敲低p53 能减轻芥子碱（50 μmol/L）对HepG2 肝癌细胞活力的抑制作用（图4C），且敲低p53 能减缓芥子碱（50 μmol/L）诱导的细胞凋亡（图4D）。以上结果表明，芥子碱通过激活p53 信号通路抑制HepG2细胞活力、诱导细胞凋亡。

图4 敲低p53基因阻遏芥子碱对细胞活力和凋亡的影响Fig.4 Knockdown of p53 suppresses the effect of sinapine on cell viability and apoptosis

2.5 芥子碱对裸鼠皮下肿瘤生长的影响 为进一步验证芥子碱在体抗肝癌作用，本研究通过皮下接种肝癌HepG2 细胞，构建裸鼠皮下肿瘤模型，接种1 周后通过腹腔注射芥子碱，定期监测皮下肿瘤的生长。结果发现，芥子碱能显著抑制裸鼠皮下肿瘤的生长（图5A）；对肿瘤组织进行蛋白水平检测发现，芥子碱处理的肝癌组织中p53、p21 及Bax 水平显著升高，Bcl-2 表达水平显著降低（图5B、C），进一步说明芥子碱可能通过激活肝癌细胞中p53信号通路从而发挥对肝癌的抑制作用。

图5 芥子碱对在体肿瘤生长及肿瘤组织中p53信号通路的影响Fig.5 Effect of sinapine on tumor growth in vivo and p53 signaling pathway in tumor tissues

3 讨论

芥子碱作为一种来源广泛的天然中药材，具有多种药理学作用，包括抑制新生血管生成、抗炎、抗氧化、降低血压、平喘等，其副作用较小，但大量服用可能引起恶心、呕吐等胃肠道刺激反应［9-11］。目前，关于芥子碱的抗肿瘤活性也有相关报道。GUO等［7］研究发现，芥子碱可通过抑制P-gp（P-glycoprotein）蛋白的表达从而发挥对结肠癌Caco-2 细胞的抑制作用；GUO 等［8］研究表明，芥子碱可通过下调ERK1/2-NF-κB 信号通路活性逆转乳腺癌MCF-7 细胞对阿霉素的抵抗，这些研究提示芥子碱能在体外抑制肿瘤细胞，同时可能作为潜在的辅助化疗药物。因此，本研究基于芥子碱的抗肿瘤活性，研究芥子碱对肝癌HepG2 细胞活力、凋亡及在体肿瘤生长的影响，并借助RNA 测序和生物信息学分析，初步探究其作用机制。

本研究使用不同浓度的芥子碱处理肝癌HepG2 细胞，结果发现芥子碱能抑制肝癌HepG2 细胞活力，并表现出时间和浓度依赖。同时，裸鼠荷瘤实验也表明，芥子碱能抑制裸鼠皮下肿瘤的生长，说明芥子碱能在体内、体外发挥抗肝癌作用。诱导细胞凋亡是药物发挥抗肿瘤作用的常见机制，因此，本研究检测芥子碱对肝癌HepG2 细胞凋亡的影响。流式细胞术结果表明，随着药物浓度的增加，HepG2 细胞凋亡率显著升高，表明芥子碱能诱导肝癌细胞凋亡。为进一步探究芥子碱抗肝癌的作用机制，本研究借助RNA-Seq 测序手段，对芥子碱处理后改变的基因进行大规模筛选，以便明确其可能影响的生物学过程和信号通路。分析基因测序结果发现，芥子碱处理后，HepG2 细胞中有869 个基因表达水平发生改变，同时对基因表达矩阵进行基因集富集分析发现，p53 信号通路显著富集，表明p53 信号通路可能在芥子碱诱导的肿瘤细胞凋亡和细胞活力降低过程中具有重要作用。

p53 作为经典的抑癌基因，在各种类型肿瘤中的作用被广泛报道，其本身可作为细胞核中的转录因子，启动下游如p21、Gadd45、Bax 等靶基因的转录，参与调控肿瘤细胞的增殖、周期、凋亡及DNA 损伤等生物学过程［12-13］；同时，其活性受磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化及棕榈酰化等各种转录后修饰的调控，参与调控使得生物学过程更为复杂，且与恶性肿瘤的发生、发展密切相关［14-15］。本研究发现，芥子碱处理后，肝癌细胞和肝癌样本中p53、p21 及Bax蛋白水平显著增加，Bcl-2蛋白水平显著降低，说明芥子碱处理能引起p53信号通路的激活。为进一步明确p53信号通路的激活在芥子碱诱导的细胞凋亡和细胞活力下降中的作用，本研究检测在p53 敲低的细胞中，芥子碱对细胞活力和细胞凋亡的影响，发现敲低p53 能部分阻遏芥子碱诱导的细胞凋亡和细胞活力下降，进一步表明芥子碱通过激活p53 信号通路发挥抗肝癌作用，同时，由于敲低p53只能部分阻遏芥子碱对肝癌细胞的作用，说明其他生物学过程或信号通路可能也发挥一定作用，这有待后续进一步探索。此外，本研究发现，芥子碱处理能引起p21蛋白水平上调，p21作为参与细胞周期调控的重要负性调控蛋白，通过抑制CDK（cyclin dependent kinase）家族蛋白活性，影响细胞周期进程［16］，因此，芥子碱也可能通过诱导细胞周期阻滞从而发挥抗肝癌作用。不过，本研究尚未深入探究芥子碱激活p53 信号通路的具体机制，这有待后续进一步探索。

综上所述，芥子碱可通过激活p53 信号通路在体内和体外发挥抗肝癌作用，后续应进一步深入探究芥子碱能否与化疗药物配伍使用及其对化疗药物药效的影响，以期为芥子碱用于临床肝癌患者的治疗提供基础。