金叶银杏杂交播种及其叶色分化1)

章雷 王改萍 丁延朋 马悟真

(南京林业大学,南方现代林业协同创新中心，南京，210000)

银杏(GinkgobilobaL.)作为我国特有的孑遗树种，其叶果不仅具有药用价值和食用价值，而且独特的叶形具有很高观赏价值[1]。杂交金叶银杏作为芽变品系，已于2014年4月被湖北省林木品种审定委员会命名为“安陆金叶银杏”[2]。近年来，关于金叶银杏开展了各项研究，如其光合特性[3]、叶色变化[4]、扦插繁殖[5]、嫁接繁殖[6]等。由于金叶银杏没有雄株，目前大都是以无性繁殖的苗木作为研究对象，研究发现，无性繁殖的苗木存在叶色性状不稳定，黄绿隔年交替，树形弯曲，不优美等问题。为了培育树干通直，株型优美，叶色性状稳定的金叶银杏实生苗，本试验以金叶银杏的杂交选育为突破点，对金叶银杏杂交育种的可行性进行探讨。

1 试验地概况

授粉试验地位于湖北省安陆市王义镇(113°10′～113°57′E，31°4′～31°19′N)，属亚热带季风气候，四季分明，年平均气温15.8 ℃，年平均降水量1 172 mm，年平均无霜期246 d，年平均日照时长2 172.7 h。该地为浅丘，以黄棕壤土为主。播种试验地位于江苏省泰兴市姚王镇(119°54′～120°21′E，31°58′～32°23′N)，同属亚热带季风气候，年平均气温14.9 ℃，降水1 027 mm，年平均无霜期220 d，年日照时长2 125 h。该地属于长江三角洲冲积平原，土壤质地为沙壤土。

2 材料与方法

2.1 试验材料及试验设计

湖北安陆10年生嫁接金叶银杏；南京林业大学二村池塘边健康优质雄株(记作“南林1号”)；南京林业大学树木园健康优质雄株(记作“南林2号”)。

杂交组合：金叶银杏(♀)×南林1号(♂)为杂交1号；金叶银杏(♀)×南林2号(♂)为杂交2号；试验以泰兴当地采种作为参考对照，记作泰兴。

2015年4月初，采集南京林业大学校园内两株雄树上成熟的雄蕊，室温晾晒后收集散落的花粉，低温冷藏法保存[7]。同时在花粉散落前，对需要开展试验的雌花所在枝条进行套袋，并统计雌花数量。当年4月上旬，于湖北安陆进行人工授粉，授粉方式采用混水喷雾法[8]。当年6月，待授粉枝条坐果后对其进行座果率的统计(座果率=(果实数/雌花数)×100%)。

当年9月，采集成熟种子，浸泡，脱去外种皮。随机选取100粒种子，利用电子天平称量种子质量(四分法)，3次重复；利用游标卡尺测量种子的长、宽、厚度；种子含水率采用烘干法，130 ℃下烘至恒质量，3次重复。种子含水率=[(种子湿质量-种子干质量)/种子湿质量]×100%。剩下的种子于冷藏室内进行沙藏，翌年用于萌发试验及播种试验。

2.2 播种试验

层积催芽期间，每隔1个月取10粒种子，共计6次，对其胚的发育进行观察统计。种子萌发试验于翌年2～3月，在实验室GZP-300C智能光照培养箱内进行，箱内温度为25 ℃，相对湿度约为80%～90%，光量子通量为40 μmol·m-2·s-1，光照周期为16 h光照、8 h黑暗。在沙藏的种子中随机各取60粒，分为3组，清水吸胀48 h后置于铺有河沙的塑料盒中进行培养。每隔2～3 d洒1次水。每天观察统计种子发芽情况，直至连续5 d没有种子发芽为止。发芽率=(发芽种子数/播种种子数)×100%。

播种试验于翌年3月22日，在泰兴试验地进行。播种方式选择条播，株行距为10 cm×15 cm。待苗木长出进行相关指标的测定。根据苗木叶色分化情况，将叶片分为杂交1号黄叶、杂交1号绿叶、杂交2号黄叶、杂交2号绿叶。

2.3 叶色参数及色素质量分数的测定

叶色参数测定：叶色参数采用X-Rite色差仪(TsD010，爱丽舍，美国)进行测定，D65光源，测色光斑直径为8 mm，本试验选择在银杏叶色变化关键时期进行了4次测定。测定时，随机选取3株具有代表性的植株，每株随机选取叶片3片，分别测定叶片的光泽亮度、红/绿程度和黄/蓝程度的参数值。其中：叶片光泽亮度参数的范围在0(黑)～100(白)；叶片的红/绿程度参数值越小绿色越深，反之红色越深；叶片的黄/蓝程度参数值越大黄色越深，反之蓝色越深。

色素质量分数的测定：叶色参数测定完后，当即采下所选植株叶片用于色素质量分数的测定。将叶片剪碎成宽约1 mm的长条，称取0.1 g，加入提取液(V(丙酮)∶V(乙醇)=1∶1)浸提24 h，叶片完全变白后，用分光光度计(UVmini-1240型，岛津，日本)测定其在440、645、663 nm时的吸光值。按照下列公式换算成叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素以及类胡萝卜素的质量分数：

式中：A663、A645、A440分别表示提取液在663、645、440 nm时的吸光值；V表示提取液的体积；W表示叶片的鲜质量。

2.4 数据处理

利用Excel 2016进行数据记录统计及相关图表的制作；利用SPSS 24.0中的Duncan法进行多重比较，利用皮尔逊相关系数法进行双变量相关性分析。

3 结果与分析

3.1 不同品系种子性状

由表1可知，采集授粉枝条所有果实，普通银杏与金叶银杏的异地授粉座果率很高，杂交1号达到90.43%。虽然杂交2号有一根授粉枝条坏死，其座果率也能达到67.11%。两杂交金叶银杏种子外形似梅核，广椭圆形，有明显棱，无翼。经过对比验证，确定其属于梅核类[9]。

表1 不同品系种子表型性状

杂交1号和杂交2号金叶银杏种子含水率显著低于泰兴(P<0.05)，杂交1号和杂交2号金叶银杏种子含水率差异不显著。其中杂交1号含水率最低，泰兴含水量最高；3个品系种子质量存在极显著差异(P<0.01)。泰兴种子的质量比杂交1号高89.5%；泰兴种子的长、宽、厚分别为27.65、16.46、14.31 mm，均为最大且极显著高于其他品系(P<0.01)。杂交1号种子的长、宽、厚分别为20.80、13.83、11.88 mm，均小于其他品系，且达到极显著水平(P<0.01)。

3.2 不同品系种子活力

银杏种子作为典型的生理后熟种子，其胚在沙藏时存在一个继续发育的过程。由表2可知，在9月份，所有种子的胚还尚未发育，均呈球状(或不明显)，未分化出明显的胚根、胚芽和胚轴；9～10月份是种子胚发育的快速时期，胚的长度迅速增长。10月份观察时可以明显看出胚的分化，整个胚呈长柱状；11月份，杂交金叶银杏种胚增长缓慢，而泰兴种子胚长仍有较大幅度的增长；12月份，所有品系种子胚长基本不再变化；翌年2月份所有种子已达到完全成熟的状态，胚长在4.8～5.6 mm，种子也具备了萌发的能力。在整个后熟的过程中，3个品系胚的发育过程基本同步。

表2 不同品系种胚的长度变化

3.3 不同品系种子萌发和播种试验

由表3可知，3个品系发芽率之间不存在显著性差异，且都能达到80%以上。其中杂交1号发芽率高于杂交2号。杂交品系种子开始萌发的时间都为16 d，比泰兴稍晚2 d。

表3 不同品系种子发芽和播种试验

3个品系种子的出苗率差异不显著，在55%～60%。其中，出苗率最高的为当地品种泰兴，杂交1号出苗率高于杂交2号。两杂交金叶银杏后代播种黄化率都达到50%以上，杂交1号黄化率高于杂交2号。

通过物候期观察，杂交金叶银杏播种后34 d开始萌发；过4 d后(4月29日)，幼苗可以长到3 cm左右，且可以看到叶片开始分化展开；5月10日，叶片完全展开，幼苗可以通过光合作用进行有机物质的合成；12月初，叶片开始逐渐脱落，其落叶时间与对照品系基本一致。

3.4 杂交金叶银杏叶色变化

由表4可知，从6—7月份，所有品系叶片光泽亮度参数(L*)值都呈下降趋势；7—8月份，杂交2号黄叶的叶片光泽亮度参数值有一个上升的过程，而其他4个品系叶片光泽亮度参数值有一个极其微弱的变化趋势；整个过程中，黄叶品系的叶片光泽亮度参数值都要显著高于绿叶品系(P<0.05)，泰兴的叶片光泽亮度参数值显著低于其他4个品系(P<0.05)；黄叶品系6月初叶片全黄的叶片光泽亮度参数值高于8月份叶片全绿，说明杂交金叶银杏叶片黄叶亮度要高于绿叶。

表4 不同品系叶片光泽亮度参数值的动态变化

从表5中可以看出，所有品系叶片红/绿程度参数(a*)值都随着时间变化逐渐降低，即叶片绿色程度在不断加深；整个过程中，叶片黄色品系的红/绿程度参数值都要显著高于(P<0.05)其他绿色品系；黄色两个品系的叶片红/绿程度参数值变化主要发生在6—7月，且在6月中旬至7月初有一个显著的降低过程，说明这段时间是叶色转绿的关键时期。

表5 不同品系红/绿的程度参数值的动态变化

由表6可知，叶片黄/蓝程度参数(b*)值的变化趋势和叶片红/绿程度参数值相同，一直呈下降趋势，即叶片黄色程度越来越低；整个过程，黄叶品系的叶片黄/蓝程度参数值都显著高于(P<0.05)绿叶品系，黄叶品系的叶片黄/蓝程度参数值主要下降时期也与叶片红/绿程度参数值同步；在6—7月份，绿叶品系的叶片黄/蓝程度参数值随时间的变化比较均匀，且无黄叶品系变化显著。

表6 不同品系叶片黄/蓝程度参数值动态变化

3.5 杂交金叶银杏的叶色素变化

由表7～10可知，无论叶绿素还是类胡萝卜素，黄叶品系与绿叶品系动态变化都存在明显的差异性。黄叶品系叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素的质量分数一直处于上升趋势，8月份叶片全绿时，相对于6月份全黄阶段，黄1和黄2品系，叶绿素a的质量分数分别提高了4.1和3.3倍，叶绿素b的质量分数分别提高了2.9和3.6倍，总叶绿素的质量分数分别提高了3.7、3.1倍；其他3个绿叶品系叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素的质量分数变化趋势趋同，在6—7月处于上升趋势，7—8月逐步下降，叶绿素a主要积累时间段为6月中上旬，叶绿素b主要积累时间段为6月下旬。所有品系类胡萝卜素的质量分数都存在先下降再上升的趋势，黄叶品系及泰兴转折点发生在6月中旬，绿叶品系发生在7月初。黄叶品系叶片全绿阶段比全黄阶段类胡萝卜素的质量分数都提高了36.2%。

表8 银杏不同品系叶片叶绿素b的质量分数

表9 银杏不同品系叶片总叶绿素的质量分数

表10 银杏不同品系叶片类胡萝卜素质量分数

3.6 黄叶品系变色期叶色参数与叶色素的相关性

由表11可知，杂交1号黄叶的叶色参数值都与叶绿素呈极显著负相关关系，即叶绿素类质量分数越高，叶片亮度越低，绿色和蓝色程度越高。3个叶色参数值与类胡萝卜素显著负相关，叶片红/绿的程度参数值达到极显著水平，即类胡萝卜素的质量分数的升高也在一定程度上使叶片变暗变绿；杂交2号黄叶品系相关性分析结果与杂交1号黄叶类似，但叶片光泽亮度参数值与叶绿素及类胡萝卜素含量都不存在相关性，且黄/蓝的程度参数值与叶绿素a的质量分数之间的关系不明显；进一步分析发现，叶色参数都与总叶绿素/类胡萝卜素的质量分数之比存在极显著相关性，总叶绿素的质量分数越大，叶片亮度越低，绿色和蓝色程度越高，黄色程度越低，叶片整体呈现出绿色。相反，类胡萝卜素的质量分数越高，叶片整体呈现黄色。

表11 叶色参数与叶色素的相关性

4 结论与讨论

金叶银杏与普通银杏的杂交效果理想，播种出苗率较高，后代黄化苗的数量也能达到50%以上。银杏的杂交完全可育，金叶银杏与普通品种之间的授粉成功率很高，授粉成功率在90%以上。通过对其种核表型观察发现，两种杂交品系属于梅核类[10-11]，和其他类型种核及普通梅核类相比，其单核种子质量偏低，两种杂交品系种子的质量分别为1.55、1.96 g。章承林等[2]对安陆金叶银杏的研究结果表明，种子单核质量达到2.5～3.13 g才被判定为种子饱满且具有生命力。显然，本杂交试验得到的两品系种子过小，但通过后期观察其胚的发育和发芽、播种试验证明，质量轻并不影响其种子活力。

银杏种子是属于高含水量的淀粉型种子，存在典型的生理后熟现象[12]，在其休眠过程中，胚的发育直接决定后期种子能否正常萌发[13]。由于种子内存在各种物质代谢(如糖、蛋白质、酶和激素等[14-17])，种子休眠的过程实际上是胚分化和种子真正成熟的过程。方诗雯[18]根据种胚长度将银杏种子后熟过程划分为5个阶段，发现在不同阶段其种子内含物及其相关基因表达量一直处于不断变化的过程。因此，在采种之后需要采用一定的贮藏措施来完成种子的生理后熟过程。本试验采取层积的方式进行贮藏，在贮藏过程中对胚的变化进行观察，杂交金叶银杏种子胚的发育主要集中在9—10月份，12月后胚长不再变化，基本判定种子完成后熟过程。Feng et al.[19]对普通银杏种子研究发现，9月中旬才可见种胚，随后胚迅速增长，分化大约经历1个月，11月后其胚增长缓慢。其动态过程与本试验结果完全一致。何青松[20]在研究银杏胚发育过程时，其形态上的动态变化也与本试验结果一致，但不同的是种胚到11月份才开始迅速增长，稍晚于本试验的银杏种子。经过5个月的低温层积，种胚完成分化，可以清晰地看到胚芽、胚轴、胚根，胚长也增长到4.8～5.6 mm。有关研究结果种子的胚长都达到1 cm左右[21-23]，本试验的两种杂交金叶银杏种子的胚长较短。造成这种现象的原因，是品种间存在差异性，杂交金叶银杏种子偏小，以及贮藏方式不同。高巍等[24]的研究表明，低温层积处理，胚的长度最短，但发芽率和发芽指数都是最高，与本试验的结果一致。

彩叶植物叶片的呈色原理与花色相同，受本身遗传基因和环境因素的共同影响，一般通过改变色素的种类、含量及分布区域来控制叶色变化[25-26]。叶绿素是植物光合作用吸收光能的主要色素，使叶片呈蓝绿色；类胡萝卜素呈黄色，性质稳定，不易降解，且对叶绿素有一定的保护作用[27]。两类色素对植物的呈色至关重要，叶绿素主要影响绿叶植物叶色变化，类胡萝卜素主要影响黄叶植物叶色变化[28]。通过叶色观察及相关色素测定后发现，在黄叶品系叶片由黄转绿的过程中，其叶绿素和类胡萝卜素含量都在不断上升。但叶片呈现黄色主要与叶片内总叶绿素和类胡萝卜素的比例存在高度极显著的相关性，在叶片由黄转绿的变色关键期，叶片内总叶绿素比例提高，而类胡萝卜素占比相对下降，最终导致杂交金叶银杏完成叶色的转变。该结论与王改萍[4]、郁万文[29]等的研究结果一致。Li et al.[30]从分子的角度研究表明，金叶银杏与普通绿叶银杏相比，金叶银杏叶片类胡萝卜素基因的相对上调和叶绿素基因的相对下调是导致其呈现黄色的原因。

因此，金叶银杏与普通银杏的杂交效果理想，播种出苗率较高。但叶色特征的稳定性，以及干形的通直情况，还需后期进一步逐年观察统计。本试验完全证明了金叶银杏杂交的可行性，这为后期的选育工作打下了良好的基础。后期可通过改变父本，扩大父本种类数量进一步全面开展相关试验。