长白山和平全季地形公园“美人松”林区康养对2型糖尿病患者血清细胞因子的影响

刘艳波 ，王焕琦 ，安丽萍 ，孙昕昳 ，包学英 ，王亚超 ，肖梓屾 ，杜培革

(1.北华大学 基础医学院，吉林 吉林132013；2.北华大学 药学院，吉林 吉林 132013；3.北华大学附属医院，吉林 吉林 132011）

随着人们生活水平的日益提高,森林康养已成为现代人休闲养生的重要方式，体验自然美妙、回归森林静谧、关注生态文明,远离城市嘈杂，使得森林康养产业得到迅猛发展。长白山和平全季地形公园是吉林省夏季森林康养的理想胜地，公园内的“美人松”林举世闻名，“美人松”秀美挺拔、枝繁叶茂，成为公园独有的一道靓丽风景，是吉林省响当当的旅游名片。“美人松”卓尔不群、风姿绰约，以其闭月羞花之妩媚，潇洒脱俗之气质被人们迷恋[1]。“美人松”林周边具备休闲娱乐区、自然步道和瑜伽区，环境优雅而富有诗意，森林本底区人迹罕至，是鸟儿和野生动物的天堂。森林环境中富含大量的负氧离子及芬多精，具有调节心理、神经、内分泌和免疫等效应[2-3]，对细胞因子的分泌亦产生影响。

2型糖尿病是一种由多种病因引起的以高血糖为特征的内分泌代谢紊乱性疾病，自然免疫及炎症反应伴随糖尿病发生发展，因此被认为是慢性低度炎症状态，与多种细胞因子失衡有关。炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1等）作为炎症反应过程中的调控因子，在2型糖尿病发生发展中发挥重要作用。TNF-α与胰岛素抵抗和胰岛β细胞损伤关系密切，TNF-α能强烈诱导促炎症因子如IL-6、IL-10和IL-18等产生及分泌，从而引起炎性反应及趋化因子释放等，其作用包括免疫调节，褪黑素生成，溶骨作用，促炎性反应等。在2型糖尿病发病过程中，TNF-α作用于酪氨酸激酶和葡萄糖转运体4，进而抑制G蛋白水平，间接诱导胰岛素抵抗。TNF-α也可直接作用于胰岛β细胞，产生NO，导致胰岛素分泌不足等效应[4-6］。

因此，本研究着重探究2型糖尿病患者在长白山和平全季地形公园“美人松”林区康养对血清细胞因子分泌的影响，为有效开发、合理利用该区康养资源提供医学研究基础。

1 材料与方法

1.1 森林康养区概况

试验地为长白山和平全季地形公园“美人松”林区，位于吉林延边朝鲜族自治州安图县二道白河镇，距长白山北坡山门6 km。

1.2 康养人群选择

在吉林市政府相关部门及当地大学筛选2型糖尿病患者12名（根据2017年美国糖尿病学会的诊断标准，患者服用二甲双胍进行治疗，未进行胰岛素注射治疗），年龄介于62～78岁中间，6名男性，6名女性，平均年龄66.85±7.29岁；患者的病程大于1年，糖化血红蛋白大于6.5%。若空腹血糖经常＜3.9 mmol/L；和/或经常＞16.9 mmol/L以上；和/或糖化血红蛋白≥11.5%均排除该次康养试验。所有志愿者无明显心血管疾病、精神疾病史，半年内未服用任何影响身心健康的药物，受试者在三个月内没有参加过森林康养或其他类似的旅行。康养过程中，三餐固定，营养搭配合理。志愿者在森林康养期间不允许饮用含有酒精的饮料。该项研究符合北华大学医学伦理学要求，康养前，所有的志愿者均亲自签署知情同意书并详细填写调查问卷，包括总体状况（年龄，性别和职业）、生活方式（饮酒，吸烟，睡眠时间，吃早餐情况，工作时间，体育锻炼，营养和精神压力）等。

1.3 康养过程

第1天下午，2型糖尿病患者在长白山白河区“美人松”林康养区漫步 2 h，康养第2天，受试者分别于上午和下午在休闲活动区漫步、做操30 min，然后行走约2.5 km，期间在森林瑜伽区进行森林冥想30 min，使身心放松。图1展示了志愿者所居住的环境、森林漫步及森林冥想情况，康养活动持续7天，康养第8天早上，志愿者抽取血样并完成问卷调查后乘车返回吉林市。除午餐时间外，所有志愿者9:00至17:00停留在森林康养区。第1天和第8天8:00早餐前完成采血及其他工作。

图1 长白山和平全季地形公园森林康养情况

1.4 细胞因子检测试剂

本研究所用的ELISA试剂盒均购自Invitrogen公司，除了TNF-α为非包被外，其余细胞因子均是事先包被，这些细胞因子的详细信息见表1，实验中所用其他试剂均为国产分析纯。

表1 细胞因子ELISA试剂详细信息

1.5 ELISA实验过程

采集森林康养前后糖尿病患者外周血，制备血清，4℃冰箱内保存。利用生物素标记的双抗体夹心酶联免疫吸附实验（ELISA)检测 IL-10、IL-12、IL-6、TNF-α、IL-18 和 IL-15 的水平。 ELISA 的主要过程为：将血清加入事先包被好的孔板内，37℃孵育2 h，将生物素标记的相关抗体加入孔板内，与辣根过氧化物酶标记的链亲和素（streptavidin-HRP）形成复合物，孵育2 h后充分洗涤，除去未结合的酶，然后加入底物A和B以生成蓝色产物，该产物在酸的作用下转化为最终的黄色，颜色的深度与样品中靶分子的浓度呈正比。利用Thermo赛默飞世尔Multiskan FC酶标仪检测相关细胞因子的水平。

1.6 数据分析方法

利用EXCEL对数据进行整理和Sigma Plot作图，数理统计软件SPSS13.0进行分析，以P＜0.05作为差异具有显著性标准。

2 结果

2.1 森林康养对血清细胞因子IL-10和IL-12的影响

IL-10血清水平386.50～622.58 pg/mL，本研究中糖尿病患者IL-10水平在康养前后变化不大，且均处于正常水平。IL-12在健康人群血清水平为35.5～42.06 pg/mL，本研究中受试者血清中IL-12在康养前后无明显变化，且处于正常水平（图2）。

图2 森林康养对2型糖尿病患者血清IL-10和IL-12水平影响

2.2 森林康养对血清细胞因子IL-6和TNF-α的影响

IL-6在健康人群血清水平为12.45～26.55 pg/mL，本研究中受试者血清IL-6在康养前高于正常水平，而康养后IL-6降至正常水平，康养前后IL-6变化显著（P＜0.05）；TNF-α在健康人群的血清浓度为13.25～35.07 pg/mL，本研究中受试者血清TNF-α水平较正常水平增加，而森林康养可降低TNF-α的分泌，康养前后血清TNF-α水平差异显著（P＜0.05）。由血清检测结果可知，IL-6与TNF-α参与了2型糖尿病的发生发展（图3）。

图3 森林康养对2型糖尿病患者血清IL-6和TNF-α水平影响

2.3 森林康养对细胞因子IL-18及IL-15的影响

IL-18在健康人群血清浓度介于80.05～190.23 pg/mL，实验结果表明：糖尿病患者血清中IL-18在康养前处于正常水平（偏高），康养8天可显著降低，说明IL-18对糖尿病的发生发展发挥效应；IL-15在正常人群的血清浓度介于39.7～74.3 pg/mL，表明糖尿病患者血清IL-15水平在康养前已经增加，而森林康养8天后IL-15水平未降低，反而较康养前增加明显（P＜0.05）（图4）。

图4 森林康养对2型糖尿病患者血清IL-18和IL-15水平影响

3 讨论

和平全季地形公园“美人松”林区位于吉林省长白山地区，属于温带大陆性山地气候，冬季寒冷漫长，夏季温湿短暂，每年7～8月是一年中气温最高、湿度最大的季节。本研究于2019年8月份对长白山和平全季地形公园“美人松”林不同康养区进行了森林挥发物的监测及各种挥发物的日变化规律分析，共鉴定出森林挥发物39种，芬多精含量丰富，并进行了森林挥发物的垂直变化规律（待发表）。在监测环境的同时，12名患有糖尿病的中老年志愿者进行了为期8 d的森林康养活动，康养在上午9:00以后进行，持续约3个小时，其中在休闲活动区进行舒缓体育运动如做操，打太极拳等，而森林瑜伽区主要进行森林冥想；于14:00后进行森林康养，持续时间约3 h，主要包括森林漫步，观看花海等。

2型糖尿病是近年发病率逐年增加的慢性疾病，胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足是2型糖尿病发病的两个关键环节，但近年来研究认为细胞因子介导的慢性炎症反应在2型糖尿病发病机制中发挥重要作用，因此2型糖尿病也被认为是先天的免疫性疾病。许多因子如白细胞介素家族（IL-6、IL-10、IL-12、IL-15 和 IL-18 等）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、 C 反应蛋白（CRP）和纤溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）等参与胰岛素抵抗。本研究证实：2型糖尿病患者在康养前其血清TNF-α水平增加，而康养后血清水平明显降低，说明森林康养具有减轻炎症反应，减少TNF-α产生及释放效应，但哪些因素影响TNF-α的产生及释放还需要进一步探讨。

IL-6和IL-15在先天性免疫及适应性免疫过程中由单核/巨噬细胞产生和释放的细胞因子，这两种细胞因子在多发性硬化、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎发生发展过程中发挥重要作用，其中IL-6在糖尿病患者血清水平明显增加，与TNF-α协同参与糖尿病发生发展过程。IL-15可诱导CD4+和CD8+T细胞的增殖，同时促进自然杀死细胞分泌大量的INF-γ和TNF-α[7]，而TNF-α是2型糖尿病的发生发展的重要因子。在糖尿病小鼠中发现IL-15表达增加，而针对IL-15的治疗可一定程度缓解1型糖尿病的发展[8]。我们的研究发现：IL-6和IL-15在糖尿病患者血清水平均升高，而8天的森林康养可显著降低血清IL-6的水平，但IL-15的水平有一定程度的增加，说明森林康养可直接抑制TNF-α和IL-6分泌。

IL-18是IL-1家族重要成员，参与多种炎症反应性疾病发生发展。赵峰等［9］发现2型糖尿病患者发病早期外周血IL－18水平明显升高；赵星等［10］认为IL－18水平升高者胰岛素抵抗逐渐加重，IL－18是胰岛素抵抗独立风险因子。Koubun Yasuda等［11］通过研究认为，IL－18增强Th1细胞极化，与IL－12有协同作用；而Wegner等［12］发现2型糖尿病患者血中IL－12水平显著升高，由此推断：IL－18在高血糖的前炎症反应环境中可激发Th1活性，可能参与了胰岛素抵抗的发生。我们研究证实：2型糖尿病患者森林康养前其血清IL-18水平显著增加（大于正常值高限），康养8天后，其血清水平降低，较康养前比较差异显著（P<0.05），由此说明IL-18参与了2型糖尿病的发生发展过程。我们同时检测了血清IL-10和IL-12的水平，发现森林康养后其水平变化不明显。动物实验证实，慢性应激诱发炎症反应，促进TNF-α、IL-1β和IL-6分泌，与糖尿病发生密切相关［13］。我们的研究证实：森林康养可降低2型糖尿病患者的应激水平，减少儿茶酚胺的释放，而儿茶酚胺具有促进胰高血糖素素分泌、降低胰岛素分泌等生物学作用，参与糖尿病发生发展［14］，细胞因子与慢性应激之间的关系在糖尿病发病中的作用有待进一步深入探讨。

综上，和平全季地形公园“美人松”林区进行为期8天的康养可显著降低血清中IL-6、IL-18和TNF-α的水平，而这3种细胞因子与糖尿病发生发展关系密切，参与胰岛素抵抗及减少胰岛分泌等多种效应。另外，森林康养通过运动本身消耗大量的能量、运动增加外周组织对胰岛素敏感性；康养环境中的有益因素如负氧离子、芬多精等减轻糖尿病患者体内的慢性炎症反应，增加外周组织对胰岛素的敏感性，对患者的身心均有裨益；在森林漫步、森林冥想和森林体操等康养课程中，通过吸入负氧离子丰富、芬多精含量高的清洁空气、聆听森林中鸟虫的鸣叫、森林中不同深浅度的绿色、配以各色的野花以及潺潺的流水等不同景观，使得视觉、听觉、味觉、触觉和嗅觉受到多方面有益刺激，使交感神经的紧张性减弱，副交感神经活性增强，儿茶酚胺释放量减少，也有助于降低血糖，愉悦身心，提高活力及免疫力等效应。