妊娠期糖尿病患者血清、胎盘组织及脐血中PECAM- 1 表达及临床意义

高立娟，刘巧香，王华莉

（河南省平顶山市平煤神马医疗集团总医院产科，河南 平顶山 467099）

妊娠期糖尿病（GDM）是最常见的妊娠并发症之一，占所有妊娠的1%～14%[1,2]。 GDM 妇女其他妊娠并发症风险增加，包括妊娠高血压、糖尿病性酮症酸中毒,产后2 型糖尿病、子代成年后患糖尿病、肥胖症、心血管疾病等代谢疾病[3]。 GDM 具有胰岛素抵抗（IR）特性，在诊断为GDM 的妇女中，IR 比例升高[4]。 研究表明，全身和局部炎症在GDM 患者IR 的发展中起着重要作用。 研究表明，血小板内皮细胞黏附分子-1 （platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1）是分泌的剪接变体，该变体识别病原体相关分子模式（PAMP）以及组织损伤的内源性指标，PECAM-1 是抑炎反应的关键介质[5]。 PECAM-1 可抑制NF-κB,活化蛋白1（AP-1）和干扰素调节因子（IRFs）在内的几种转录因子而导致促炎性细胞因子的弱表达。 这些细胞因子可以直接或间接抑制胰岛素靶细胞中的胰岛素作用[6]。 PECAM-1 是IR 中潜在的分子功能。 在糖尿病动物模型以及T1DM 和T2DM 患者中观察到PECAM-1 的表达降低。 以前的研究还发现GDM患者中PBMC, 骨骼肌和脂肪组织中PECAM-1 的表达明显下降。 此外,激活PECAM-1 信号传导可以改善IR[7,8]。 也有研究发现肝细胞特异的PECA M-1 过表达可减轻饮食引起的全身和局部IR[9]。本研究拟探讨GDM 患者血清、 胎盘组织及脐血中PECAM-1 表达及临床意义，为GDM 的发病、治疗机制提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2016年8月至2019年9月，平煤神马医疗集团总医院96 例行剖宫产手术的妊娠期糖尿病孕妇为病例组，根据国际糖尿病与妊娠研究小组（IADPSG）标准在妊娠24～28 周时通过口服葡萄糖耐量试验（75 g）对妊娠期糖尿病进行诊断，并根据国际妇产科联合会（FIGO）建议进行饮食管理和生活方式调整以及药物干预（二甲双胍、胰岛素）。 根据年龄、BMI、身高、体重、妊娠周数进行匹配选取2016年8月至2019年9月本院96例行剖宫产手术的正常孕妇为对照组。 该研究得到本院伦理委员会的批准和审查，剖宫产前已获得研究对象知情同意书。 纳入标准：⑴单身妊娠；⑵年龄18～40岁；⑶符合IADPSG 诊断标准；⑷研究对象自愿提供血清、胎盘组织及脐血；⑸经过本院医学伦理协会批准。 排除标准：⑴多胎妊娠；⑵感染或其他妊娠并发症； ⑶先天性或染色体异常或糖尿病家族史。

1.2 方法

1.2.1 血清及脐带血中PECAM-1 表达水平测定用TRIzol 试剂 （美国Invitrogen Life Technologies公司，批号：SD-77896.36）从血清及脐带血中提取总RNA。 使用TaqMan mRNA 试剂盒（美国Applied Biosystems，批号：CV-556963.36） 将总RNA逆转录为互补DNA （cDNA）。 PECAM-1、GAPDH引物由华大基因合成，序列如下：PECAM-1F：5'-TGCTAGCTAGTCGCGTCGATCGTGATCGATGCTA GCT -3' 和R：5'-TCGCGCTGCGTCGTCGATGCTA GCTCGTCGTAGCTCGATG-3'; GAPDHF：5'-CTCCGCTACTAGCTGCTAGCTGCTAGCTAGTCGCTAG CTGCA-3' 和R：5'-TCGCTAGCTAGTAGCTAGCTGACTGATCGTCG-3'。 使用SYBR Green 试剂盒（中国碧云天生物科技，批号：XS-559686.36）以及7300 实时PCR 系统（美国Applied Biosystems）进行实时荧光逆转录反应； 热循环参数进行：16°C 30min，42°C 30min，在85°C 下放置5min，然后在4°C 下放置。 2-ΔΔCT 计算PECAM-1 表达水平，并标准化至GAPDH。

1.2.2 胎盘中PECAM-1 蛋白表达水平测定 如下对胎盘样品中的PECAM-1 进行免疫组织化学分析。胎盘组织石蜡包埋并切成4μm 的厚度。将玻片在二甲苯中脱蜡两次，持续10min，然后通过降低乙醇浓度将其重新水化。 在0.01 mol/L 柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中于98°C 至100°C 的微波炉中进行10min 的抗原回收。 在室温下，使用3%过氧化氢（在新鲜甲醇中） 封闭内源过氧化物酶活性10min 温度。 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤后，将切片与封闭血清温育1h。 然后，将组织与兔PECAM-1 抗体（AF1086,1：40; R&D Systems，Minneapolis，MN，USA）在4°C 孵育过夜。 作为二级抗体，使用辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗小鼠IgG （ 美国Dako Envision plus System，批 号：SD448596.36），用DAB 观察阳性染色。两名不知情的观察员对结果进行评估。 PECAM-1 染色强度分级如下：0 表示无染色，1+弱染色，2+中度染色，3+强染色。 根据PECAM-1 阳性细胞的百分比对分布进行分级，然后如下划分为四分位数：0，0～5%染色；1+，6～25%染色；2+，26～50%染色；3+，51～75%染色；4+，76～100%染色。 使用0～3 的评分标准（0：0～4%细胞染色；1：5～29%细胞染色；2：30-59%细胞染色；3：60～100%细胞染色测定免疫反应细胞百分比的估计值）。 染色强度评分为0～3（0，阴性；1，弱；2，中等；3，强）。 然后将数量和染色强度评分的值相乘，得到范围为0 至9 的结果。

1.3 统计分析 应用SPSS23.0 对数据进行录入、统计学分析。 计量资料以均数±标准差表示，采用t 检验比较，检验水准α 为0.05。

2 结果

2.1 两组一般情况比较 对照组和病例组年龄、BMI、身高、体重、妊娠周数等一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表1。

表1 两组一般情况比较

2.2 两组糖脂代谢指标比较 与对照组比较，病例组TG、TC、LDL-C、FBG、FINS、HOMA-IR、HOMAISI 水平升高，HOMA-β 水平降低（P＜0.05）。 见表2。

表2 两组糖脂代谢指标比较

2.3 对照组和病例组中血清PECAM-1 mRNA、脐血PECAM-1 mRNA 表达比较 与对照组比较，病例组血清PECAM-1 mRNA、 脐血PECAM-1 mRNA 表达水平降低（P＜0.05）。 见表3。

表3 对照组和病例组中血清PECAM- 1mRNA、脐血PECAM- 1 mRNA 水平比较

2.4 对照组、病例组中胎盘PECAM-1 蛋白表达评分比较 与对照组比较，病例组胎盘组织PECAM-1 蛋白表达阳性率、PECAM-1 蛋白表达评分降低（P＜0.05）。 见表4。

表4 对照组、病例组中PECAM- 1mRNA 水平比较

2.5 血清PECAM-1 mRNA、胎盘PECAM-1 蛋白、脐血PECAM -1 mRNA 与各变量相关性 血清PECAM -1mRNA、 胎盘PECAM -1 蛋白、 脐血PECAM -1 mRNA 与TG、TC、LDL -C、FBG、FINS、HOMA-IR、HOMA-ISI 负相关，与HOMA-β 正相关（P＜0.05）。 见表5。

表5 血清PECAM- 1mRNA、胎盘PECAM- 1 蛋白、脐血PECAM- 1 mRNA 与各变量相关性

2.6 妊娠发生糖尿病的多因素Logistic 回归分析以妊娠妇女是否发生糖尿病为应变量（是=1，否=0），各血清指标为自变量进行多因素logistic 逐步回归分析，结果发现：血清PECAM-1 mRNA、胎盘PECAM -1 蛋白、 脐血PECAM -1 mRNA、FBG、FINS、TC、HOMA-IR 均为妊娠妇女发生糖尿病的危险因素（P＜0.05）。 见表6。

表6 妊娠孕妇出现糖尿病的多因素Logistic 回归分析

图1 PECAM- 1 在对照组、病例组胎盘组织的表达

3 讨论

越来越多的证据表明，炎症分子的系统性和局部产生可能对导致GDM 中的IR 至关重要，包括CRP、TNF-α 和IL-6。 PECAM-1 是抑炎反应的候选者。 PECAM-1 在受到LPS 和有害代谢产物的刺激后，它将螯合下游分子MyD88，阻止转录因子NF-kB 向核转移，并抑制促炎性细胞因子和趋化因子的产生，包括IL-6、TNF-α、趋化因子（CC 基序）配体2（CCL2），这些细胞因子都将在IR 中起决定作用[10]。 先前对IR 的研究集中在肝脏、脂肪组织或骨骼肌。 本研究将重点放在胎盘上，并辅助检测脐血、血清PECAM-1 表达水平。 胎盘作为母胎界面执行各种功能的载体，在GDM 的发展和进程中发挥关键作用。 胎盘来源的激素，人胎盘乳原（hPL）和人胎盘生长激素（hPGH）被认为是重编程产妇生理学以实现胰岛素抵抗状态的主要因素。此外，GDM 妇女胎盘中炎症途径的上调基因以及脂质，氨基酸和葡萄糖转运的基因，也在全身或局部IR 中起作用。

PECAM-1 及其各种共受体和必需蛋白（包括CD14）的表达改变已在人胎盘中描述，并且在妊娠并发症中也有所改变。 在绒毛膜羊膜炎（CAM）早产的胎盘中绒毛状Hofbauer 细胞中的PECAM-1表达低于没有CAM 的早产胎盘，或有或没有CAM的足月胎盘；较低水平的PECAM-1 水平发生在妊娠并发先兆子痫的胎盘中[11]。 与上述的研究一致，与对照组比较，病例组胎盘组织PECAM-1 蛋白表达阳性率、PECAM-1 蛋白表达评分降低（P＜0.05）。本研究在GDM 胎盘的各种细胞中观察到了PECAM-1 的表达，包括合体滋养层细胞，内皮细胞，蜕膜细胞和羊膜上皮细胞，且合胞体滋养层和成纤维细胞染色最弱。 研究表明PECAM-1 的表达可能与胎盘部位有关，本研究发现，PECAM-1在胎盘与母体接触部位表达最弱，这可能归因于胎盘的母体部分与母体有更多的血液交流，而大量刺激性物质的母血可以抑制PECAM-1。 除微生物外，组织损伤的内源性信号也可以抑制PECAM-1，其中包括来自凋亡，损伤相关分子模式的碎片，ECM 降解产物，高迁移率box-1 蛋白（HMGB1），脂肪酸，热激蛋白，AGEs 在组织损伤和发炎时释放[12，13]。 本研究同时也检测了，血清脐带血中PECAM-1 水平，结果显示，与对照组比较，病例组血清、 脐血PECAM-1 mRNA 表达水平降低（P＜0.05）。 这与胎盘研究结果一致。

近期研究表明,糖脂代谢异常和游离饱和脂肪酸的积累也可能在胎盘PECAM-1 途径的抑制中具有潜在作用。 对肝细胞、脂肪组织和骨骼肌的研究表明，PECAM-1 在局部胰岛素敏感性中起重要作用[14]。 在GDM 的胎盘中已经检测到胰岛素信号传导受损。 胎盘是胰岛素受体的丰富来源，也是妊娠中胰岛素的靶组织[15]。 胰岛素的受体水平可通过周围的胰岛素浓度来调节[16-18]。 研究表明,在GDM中，总胎盘和滋养细胞膜中的胰岛素受体蛋白发生了变化，且PECAM-1 与胰岛素受体蛋白相关性明显。 本研究检测血糖脂水平，结果显示： 血清PECAM-1 mRNA、 胎盘PECAM-1 蛋白、 脐血PECAM -1 mRNA 与TG、TC、LDL -C、FBG、FINS、HOMA-IR、HOMA-ISI 负相关，与HOMA-β 正相关（P＜0.05）。 这表明，PECAM-1 与GDM 的脂质代谢紊乱以及IR 相关。 本研究也探讨了妊娠妇女发生糖尿病的相关因素，结果发现：血清PECAM-1 mRNA、胎盘PECAM-1 蛋白、脐血PECAM-1 mRNA、FBG、FINS、TC、HOMA-IR 均为妊娠妇女发生糖尿病的相关因素（P＜0.05）。 这提示血清、胎盘、脐血PECAM-1 为妊娠妇女发生糖尿病的危险因素，可作为GDM 的治疗靶点。 由于大多数GDM 患者一旦被诊断出就接受了干预，包括饮食管理、运动甚至胰岛素治疗，这些治疗对PECAM-1 表达的影响尚不清楚，这将在后续研究中探讨。

综上所述，妊娠期糖尿病患者血清、胎盘组织及脐血中PECAM-1 表达水平降低；PECAM-1 为妊娠妇女发生糖尿病的相关因素。