七氟烷通过调控miRNA 表达影响人脑胶质瘤的生物学特性

韩劲松 姜崇发 李印玉 侯俊锋 谢宏伟 李治松

（1 周口市中心医院麻醉科,河南 周口 466000;2 郑州大学第一附属医院麻醉科）

脑胶质瘤是常见的脑原发性恶性肿瘤，其恶性程度高，侵袭性强、易复发，手术结合放化疗、分子靶向治疗等综合治疗手段能有效降低肿瘤复发，提升患者生存率〔1〕。麻醉药是手术中常用药物，研究麻醉药对胶质瘤细胞转移的影响，并阐明其可能的机制，可为合理应用麻醉药及改善患者预后提供新思路〔2〕。七氟烷是一种新型吸入麻醉药，理化性质稳定，具有平稳诱导、苏醒快、有一定的肌松作用等优点，已广泛应用于临床麻醉〔3〕。七氟烷可抑制人乳腺癌细胞的转移能力，其机制可能与下调基质金属蛋白酶（MMP）-9 表达有关〔4〕。七氟烷能抑制人肺腺癌A549 细胞增殖，促进细胞凋亡，增强A549 细胞对顺铂的敏感性，还通过下调MMP-2、MMP-9 抑制A549 细胞的侵袭、迁移〔5〕。用七氟烷麻醉患者含药血清处理人胶质瘤细胞SHG-44，可抑制细胞增殖、侵袭和迁移能力〔6〕。但七氟烷影响人脑胶质瘤生物学特性的机制还尚不清楚。微小RNA（miRNA）可以通过调控靶基因表达影响脑胶质瘤进展〔7〕。研究发现miR-139-5p 过表达可抑制胶质瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡〔8〕。miR-139-5p 还可通过与E26 转录因子（ETS1）相互作用抑制肝细胞癌的增殖，迁移和侵袭〔9〕。神经元五聚蛋白（NPTX）1 定位于染色体17q25.3，调节多种细胞生物学过程，NPTX1 在结肠癌中下调表达，NPTX1 过表达通过下调细胞周期蛋白A2 和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）2 表达抑制结肠癌细胞增殖〔10〕。NPTX1 还是脑缺氧缺血性损伤的新型介质，与缺氧神经元损伤相关〔11〕。但NPTX1 对脑胶质瘤的影响及七氟烷是否通过miR-139-5p 和NPTX1 影响脑胶质瘤的生物学行为还尚不清楚。本实验研究七氟烷是否通过miR-139-5p 和NPTX1 影响脑胶质瘤的进展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 胶质瘤细胞A172 购自美国ATCC 库；DMEM 培养基、四甲基偶氮唑盐（MTT）试剂盒购自美国Sigma 公司；七氟烷购自日本Maruishi Pharmaceutical 公司；Transwell 小室、基质胶购自美国BD 公司；Trizol 试剂、荧光定量试剂盒购自美国Invitrogen 公司；蛋白提取试剂盒、双荧光素酶检测试剂盒购自北京Solarbio 公司。anti-miR-con、antimiR-139-5p、miR-con、miR-139-5p、pcDNA 和pcDNA-NPTX1 载体质粒由上海伯易生物科技有限公司构建。

1.2 细胞培养与分组 将细胞A172 分别在通入1.25%、2.50%、5.00% 的七氟烷和5% CO2+95%O2的DMEM 培养基中培养，气流量均为1 L/min，作为七氟烷处理组分别记为Sevoflurane 1.25%、2.50%、5.00% 组，对照（NC）组只通入5% CO2+95% O2。将pcDNA 和pcDNA-NPTX1 质粒分别转染至A172 细胞中再用5.00%的七氟烷处理，分别记为Sevoflurane+pcDNA 组、Sevoflurane+pcDNANPTX1 组。

1.3 MTT 检测细胞存活率 各组细胞培养24 h、48 h、72 h，按试剂盒说明操作加入MTT 试剂，酶标仪检测490 nm 的吸光度（OD）值。计算细胞存活率=实验组OD 值/对照组OD 值×100%。

1.4 Transwell 检测细胞迁移和侵袭 迁移:取200 μl细胞悬液接种于Transwell 小室上室，下室加含血清培养基，培养24 h，分别经多聚甲醛固、0.1%结晶紫染色，显微镜下观察并计数。侵袭:用基质胶包被Transwell 上室，风干后按照迁移实验步骤操作。

1.5 Western 印迹检测MMP-9、MMP-2、NPTX1、上皮钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、神经钙黏蛋白（N-cadherin）表达水平 提取细胞总蛋白，定量后上样并进行电泳，然后转至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，封闭后加入一抗4℃孵育过夜；再加入二抗室温孵育2 h，显影，定影，分析蛋白条带吸光度值，计算蛋白相对表达水平。

1.6 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测miR-139-5p 和NPTX1 mRNA 表达水平 提取细胞总RNA，反转录成cDNA，按照荧光定量试剂盒配制反应体系，miR-139-5p 和NPTX1 分别以U6 和β-actin 为内参进行PCR 扩增，相对表达量采用2-△△Ct法计算。

1.7 荧光素酶报告实验检测miR-139-5p 和NPTX1的靶向关系 构建NPTX1 野生型和突变型荧光素酶表达载体WT-NPTX1 和MUT-NPTX1，将其分别与miR-con 和miR-139-5p 共转染至A172 细胞中，按照说明书操作检测荧光活性。将anti-miR-con、antimiR-139-5p、miR-con、miR-139-5p 分别转染至A172细胞中，Western 印迹检测NPTX1 蛋白表达水平。

1.8 统计学分析 采用SPSS20.0 软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结果

2.1 不同浓度七氟烷对胶质瘤细胞增殖的影响 与NC 组相比，不同浓度七氟烷处理胶质瘤细胞48 h、72 h后，细胞存活率显著降低（P＜0.05）。见表1。

表1 七氟烷对人脑胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响(,n=9)

表1 七氟烷对人脑胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响(,n=9)

与NC 组比较:1）P＜0.05；表2 同

2.2 人脑胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响 与NC组相比，不同浓度七氟烷组脑胶质瘤细胞迁移和侵袭数量显著降低，MMP-9、MMP-2 表达水平显著降低（P＜0.05）。见表1、图1、图2。

图1 Transwell 检测胶质瘤细胞迁移和侵袭(结晶紫染色,×200)

图2 Western 印迹检测胶质瘤细胞MMP-2 和MMP-9 的表达

2.3 不同浓度七氟烷对胶质瘤细胞miR-139-5p 和NPTX1 蛋白的影响 与NC 组相比，不同浓度七氟烷组miR-139-5p 表达水平显著升高，NPTX1 mRNA和蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。见图3，表2。

图3 Western 印迹检测胶质瘤细胞NPTX1 的表达

表2 不同浓度七氟烷对胶质瘤细胞miR-139-5p 和NPTX1 蛋白的影响(,n=9)

表2 不同浓度七氟烷对胶质瘤细胞miR-139-5p 和NPTX1 蛋白的影响(,n=9)

2.4 miR-139-5p 靶向调控NPTX1 表达 starBase预测到NPTX1 与miR-139-5p 存在结合位点（图4）。miR-139-5p 与WT-NPTX1 共转染后细胞的荧光素酶活性显著降低（P＜0.05，表3）。miR-139-5p 组NPTX1 表达水平显著低于miR-con 组（0.21 ±0.03 vs 0.66±0.05；P＜0.05）；anti-miR-139-5p 组NPTX1 表达水平显著高于anti-miR-con 组（1.17±0.13 vs 0.71±0.07，P＜0.05）。见图5。

图4 miR-139-5p 与NPTX1 存在靶向序列

图5 miR-139-5p 调控NPTX1 蛋白表达

表3 荧光素酶活性(,n=9)

表3 荧光素酶活性(,n=9)

2.5 过表达NPTX1 逆转了七氟烷对胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭的调控作用 与NC 组相比，Sevoflurane 组胶质瘤细胞活性和迁移和侵袭数量显著降低，NPTX1、MMP-9、MMP-2 表达水平显著降低（P＜0.05）；与Sevoflurane+pcDNA 组相比，Sevoflurane+pcDNA-NPTX1 组胶质瘤细胞活性和迁移和侵袭数量显著升高，NPTX1、MMP-9、MMP-2 表达水平显著升高（P＜0.05）。见图6、表4。

图6 Western 印迹检测胶质瘤细胞NPTX1、MMP-2 和MMP-9 的表达

表4 过表达NPTX1 逆转了七氟烷对胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭的调控作用(,n=9)

表4 过表达NPTX1 逆转了七氟烷对胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭的调控作用(,n=9)

与NC 组比较:1）P＜0.05；与Sevoflurane+pcDNA 组比较:2）P＜0.05；下表同

2.6 过表达NPTX1 逆转了七氟烷对胶质瘤细胞EMT 的抑制作用 与Sevoflurane+pcDNA 组相比，Sevoflurane+pcDNA-NPTX1 组E-cadherin 表达水平显著降低，Vimentin、N-cadherin 表达水平显著升高（P＜0.05）。见图7，表5。

图7 Western 印迹检测胶质瘤细胞E-cadherin、Vimentin 和N-cadherin 的表达

表5 过表达NPTX1 和七氟烷对胶质瘤细胞EMT 的影响(,n=9)

表5 过表达NPTX1 和七氟烷对胶质瘤细胞EMT 的影响(,n=9)

3 讨论

七氟烷作为一种麻醉药，其麻醉深度易调节、对循环抑制轻、呼吸道刺激小，有良好可控性，且有研究发现其对脑有一定的保护作用〔12，13〕。七氟烷可抑制低氧诱导的小鼠肺癌细胞侵袭和迁移能力〔14〕。七氟烷通过调控Wnt/β-catenin 信号通路影响MMP-2、MMP-9 蛋白水平，从而抑制乳腺癌MDAMB-231 细胞的侵袭、迁移能力〔15〕。七氟烷可通过下调MMP-2 和MMP-9 蛋白表达，进而抑制人结直肠癌HCT116 细胞的迁移和侵袭〔16〕。本实验中七氟烷处理A172 细胞后，MMP-2、MMP-9、Vimentin、N-cadherin 表达水平显著降低，E-cadherin 表达水平显著升高。MMP-2、MMP-9 属于MMPs 家族，与细胞迁移和侵袭相关，Vimentin、N-cadherin、E-cadherin均是上皮间质转化（EMT）的相关生物标志物，Vimentin、N-cadherin 低表达、E-cadherin 高表达抑制EMT〔17〕。说明七氟烷可能通过调控EMT 影响胶质瘤细胞迁移和侵袭。且有报道显示七氟烷可促进人脑胶质瘤细胞A172 对替莫唑胺的敏感性〔18〕。本实验结果显示，七氟烷处理A172 细胞后，细胞存活率显著降低，迁移和侵袭数量显著降低。说明七氟烷可抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭。研究报道miR-139-5p 可通过调节Flt1 介导的Wnt/β-catenin通路抑制胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭和EMT〔19〕。miR-139-5p 能通过靶向Notch1 抑制胶质瘤转移和EMT〔20〕。NPTX1 是一种分泌蛋白，在人类多能干细胞（hPSCs）的神经诱导中迅速上调〔21〕。NPTX1 高甲基化与肺癌总体生存率差相关〔22〕。miR-128-3p通过靶向NPTX1 抑制胶质瘤细胞增殖〔23〕。本实验结果显示，此外，七氟烷处理A172 细胞后，miR-139-5p 表达水平显著升高，NPTX1 表达水平显著降低。miR-139-5p 可靶向调控NPTX1，过表达NPTX1 逆转了七氟烷对胶质瘤细胞的作用。

综上所述，七氟烷可通过调控miR-139-5p/NPTX1 抑制胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭和EMT。