萝卜硫素通过Notch 通路抑制结肠癌SW480 细胞增殖、侵袭、迁移

邢明远 赖志亨 马萌

（海南省中医院 1 肿瘤科,海南 海口 570203;2 肛肠科;3 陕西中医药大学附属医院肿瘤科）

结肠癌原发于结肠黏膜上皮，恶性程度高，其是消化系统常见的恶性肿瘤，也是临床上癌症相关死亡的主要原因，且近几年随着我国经济的迅速发展，快节奏的生活方式和不良的生活习惯，导致结肠癌的发病率逐年提高，严重威胁人们的生命健康〔1～3〕。随着对中医学的深入研究，发现中医在临床治疗肿瘤中发挥重要作用，为临床上治疗肿瘤扩展了新思路。萝卜硫素又称为菜菔子素，作为提取于十字花科蔬菜中的一种异硫氰酸酯类天然活性物质，其能够诱导产生Ⅱ型解毒酶，从而调控癌细胞生物学进程，防止乳腺癌等扩散与蔓延〔4〕。Notch 信号通路在癌症中受到广泛关注，其能够调控Hes1 等下游因子表达进而介导细胞增殖、凋亡等生理病理过程〔5〕。研究发现，Notch 信号通路与结肠癌的发生发展密切相关〔6〕，其中Notch1 在人结肠癌组织中呈高表达，结肠癌SW480 细胞增殖受抑制同时，Notch1、Hes1 mRNA 和蛋白表达水平亦显著下调〔7〕。此外，杨正宏等〔8〕研究发现萝卜硫素能抑制结肠癌HT-29 细胞增殖、血管形成并促进细胞凋亡，可能与抑制Notch1 表达有关。本研究将以结肠癌SW480 细胞为研究对象，基于Notch 信号通路探究萝卜硫素对SW480 细胞增殖、侵袭、迁移的影响，以期为结肠癌治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器 人结肠癌SW480 细胞（货号:C4115，美国ATCC 公司），萝卜硫素（≥98%，货号:BP0219，成都格纯生物医药有限公司），胰酶溶液（货号:C0201，杭州碧云天生物研究所），胎牛血清（FBS）、RPMI1640 培养基、四甲基偶氮唑蓝（MTT）试剂（货号:KL-NXQ05、KL-S764、KL-S0050，上海康朗生物科技有限公司），兔抗人Notch1、Notch3、Hes1、β-actin 抗 体（货 号:K10957-JRY、K21355-RPK、K17548-MTX、K10085-OZI，北京百奥莱博科技有限公司），兔抗人Ki-67、增殖细胞核抗原（PCNA）、基质金属蛋白酶（MMP）-9、E-钙黏蛋白（E-cadherin）抗体（货号:FNab09788、FNab06217、FNab05247、FNab10112，武汉菲恩生物科技有限公司），山羊抗兔IgG（H+L）辣根过氧化物酶（HRP）（货号:BM3894，武汉博士德生物工程有限公司）。CO2培养箱（型号:INC108，德国Heraeus 公司），流式细胞仪（型号:FACSCanto Ⅱ，美国BD 公司），蛋白电泳及电转移装置（型号:AU5800，北京市六一仪器厂），酶联免疫分析仪（型号:EVO75，澳大利亚Techan 公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将人结肠癌SW480 细胞接种于RPMI1640 培养液（RPMI1640 培养基中添加1%青链霉素双抗和10% FBS）中，在37℃、5% CO2、98%相对湿度的培养箱中常规培养。观察细胞状态，当细胞的融合度达70%～80%时，胰酶溶液消化传代，收集对数期细胞进行后续实验。

1.2.2 MTT 比色法筛选萝卜硫素对SW480 细胞的作用浓度 SW480 细胞密度调整为5×104个/ml，随后以每孔200 μl 接种到96 孔板上，常规培养过夜后弃培养液，加入含不同浓度萝卜硫素〔终浓度分别为0（对照）、1、2、5、10、20、40 μmol/L〕的RPMI1640 培养液，每个浓度设置6 个复孔。继续培养48 h 后每孔添加25 μl MTT 溶液（5 mg/ml），再继续培养4 h 后弃上清液，每孔加入150 μl 二甲基亚砜（DMSO）溶液，于摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，最后用酶标仪（波长490 nm）测定各孔吸光度（OD 值），计算SW480 细胞增殖抑制率，并绘制细胞生长曲线。细胞增殖抑制率（%）=（OD 值对照组-OD 值实验组）/OD 值对照组×100%。

1.2.3 细胞分组及处理 将SW480 细胞分为对照组、低、中、高浓度组，其中对照组不进行药物处理，低、中、高浓度组分别采用1、2、5 μmol/L 萝卜硫素处理。

1.2.4 平板克隆实验测定SW480 细胞集落形成能力 取对数期SW480 细胞，胰蛋白酶消化制备单细胞悬液，接种于6 孔板中，按照1.2.3 分组处理细胞，静置培养2 w 后，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养，弃去上清液，甲醇固定、结晶紫染色，洗去染色液，洗涤后在显微镜下计数细胞个数≥50 的单克隆集落，计算集落形成率（表示SW480 细胞集落形成能力）。集落形成率（%）=集落数/接种数×100%。

1.2.5 Transwell 侵袭实验测定SW480 细胞侵袭能力 将200 μg/ml 基质胶以200 μl/cm2铺在Transwell 小室上室，待其凝固，备用。用RPMI1640 培养液（不含FBS）将SW480 细胞调整为1×105个/ml的细胞悬液，取200 μl 细胞悬液接种到Transwell 上室，600 μl 含10% FBS 的RPMI1640 培养液加入下室，待SW480 细胞贴壁后弃上清液，按照1.2.3 分组处理细胞（RPMI1640 培养液不含FBS），每组设置6 个复孔。继续培养48 h 后取出Transwell 小室，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3 次后用棉球轻擦上室滤膜表面残存细胞，在4℃下10%甲醛固定10 min，PBS 洗涤后室温下0.1%结晶紫染色30 min，PBS 再次洗涤。倒置显微镜下观察染色细胞，随机选择6个视野计数（即侵袭细胞数，表示SW480 细胞侵袭能力），结果取平均值。

1.2.6 划痕实验测定SW480 细胞迁移能力 将SW480 细胞接种于6 孔板，当其单层平铺底部时，用灭菌后的200 μl 枪头垂直于底部，均匀划出一道划痕，随后用PBS 洗涤3 次，用倒置显微镜观察划痕并拍照（记录为0 h 划痕距离），接着按照1.2.3分组处理细胞（RPMI1640 培养液不含FBS），每组设置6 个复孔。继续培养48 h 后用倒置显微镜观察细胞划痕情况并拍照（记录为48 h 划痕距离），计算划痕愈合率（表示SW480 细胞迁移能力）。划痕愈合率（%）=（0 h 划痕距离-48 h 划痕距离）/0 h划痕距离×100%。

1.2.7 Western 印迹法测定SW480 细胞中Notch 通路相关蛋白、增殖相关蛋白及迁移侵袭相关蛋白表达水平 将SW480 细胞接种于6 孔板，按照1.2.3分组处理细胞48 h 后收集细胞，用细胞裂解液充分裂解后离心，以提取各组SW480 细胞总蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法测定蛋白浓度。各组取50 μg 蛋白上样，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后转至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5% BSA 室温封闭1 h 后加入兔抗人Notch1、Notch3、Hes1、Ki-67、PCNA、MMP-9、E-cadherin 及内参β-actin 抗体（稀释比例均为1 ∶1 000）作为一抗，4℃孵育过夜，PBS 洗涤3 次后加入HRP 标记的山羊抗兔IgG（稀释比例1 ∶1 000）作为二抗，室温孵育30 min，PBS 洗涤后ECL 显色，Tanon 凝胶分析系统扫描图像，分析各条带灰度。

1.3 统计学分析 采用SPSS25.0 软件进行t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结果

2.1 萝卜硫素对SW480 细胞作用浓度的筛选结果 与0 μmol/L 萝卜硫素处理SW480 细胞后，细胞增殖抑制率〔（2.01±0.91）%〕相比，1、2、5、10、20、40 μmol/L 萝卜硫素处理SW480 细胞后，细胞增殖抑制 率〔（7.29 ± 2.06）%，（13.09 ± 4.28）%，（27.18±4.54）%，（37.98 ± 5.91）%，（55.84 ±7.53）%，（79.85±8.54）%〕均显著升高，并呈浓度依赖性（均P＜0.05）。当萝卜硫素浓度≤5 μmol/L时，作用48 h后SW480 细胞增殖抑制率均＜30%，即此时细胞相对活力＞70%，故选取萝卜硫素浓度为1、2、5 μmol/L进行后续实验，以防止细胞活力过低影响Transwell 侵袭实验和划痕实验结果。

2.2 萝卜硫素对SW480 细胞集落形成能力的影响 与对照组SW480 细胞集落形成率〔（77.16 ±6.14）%〕相比，低、中、高浓度组〔（63.04 ±4.98）%，（51.18±6.79）%，（39.44±6.08）%〕显著降低；且呈浓度依赖性（均P＜0.05）。见图1。

图1 萝卜硫素对SW480 细胞集落形成能力的影响(结晶紫染色,×40)

2.3 萝卜硫素对SW480 细胞侵袭能力的影响 与对照组SW480 细胞侵袭细胞数〔（85.26±9.19）个〕相比，低、中、高浓度组〔（69.09±8.95）个，（53.68±7.78）个，（39.94±6.26）个〕显著减少且呈浓度依赖性（P＜0.05）。见图2。

图2 萝卜硫素对SW480 细胞侵袭能力的影响(结晶紫染色,×200)

2.4 萝卜硫素对SW480 细胞迁移能力的影响 与对照组 SW480 细 胞划痕愈 合率〔（94.47 ±10.56）%〕 相 比，低、中、高浓度 组〔（76.48 ±9.17）%，（61.17±9.69）%，（42.85±7.46）%〕显著降低，且呈浓度依赖性（均P＜0.05）。见图3。

图3 萝卜硫素对SW480 细胞迁移能力的影响(×100)

2.5 萝卜硫素对SW480 细胞中Notch 通路的影响 与对照组相比，低、中、高浓度组SW480 细胞中Notch 通路相关蛋白Notch1、Notch3、Hes1 相对表达量均显著降低，且呈浓度依赖性（均P＜0.05）。见表1，图4。

表1 萝卜硫素对SW480 细胞中Notch 通路、Ki-67、PCNA、MMP-9、E-cadherin 蛋白表达的影响(,n=6)

表1 萝卜硫素对SW480 细胞中Notch 通路、Ki-67、PCNA、MMP-9、E-cadherin 蛋白表达的影响(,n=6)

与对照组比较:1）P＜0.05；与低浓度组比较:2）P＜0.05；与中浓度组比较:3）P＜0.05

图4 萝卜硫素对SW480 细胞中Notch 通路的影响

2.6 萝卜硫素对SW480 细胞中增殖及迁移侵袭相关蛋白表达的影响 与对照组相比，低、中、高浓度组SW480 细胞中Ki-67、PCNA、MMP-9 蛋白相对表达量显著降低，E-cadherin 蛋白相对表达量显著升高，且均呈浓度依赖性（均P＜0.05）。见表1，图5。

图5 萝卜硫素对SW480 细胞中Ki-67、PCNA、MMP-9、E-cadherin 蛋白表达的影响

3 讨论

结肠癌的发病率和死亡率仍呈逐年上升趋势，手术切除、放疗、化疗、生物治疗或分子靶向治疗是其常用临床治疗方式，随着科学技术的进步、综合治疗的发展，结肠癌患者的预后虽有一定程度改善，但肿瘤浸润深或有淋巴结转移的结肠癌患者生存率仍较低，且放疗、化疗副作用大，严重影响患者的生活质量〔9，10〕。

研究发现，萝卜硫素能够抑制人结肠癌HT-9细胞、SW620 细胞增殖，并诱导其凋亡，且抑制SW620 细胞侵袭及转移的机制可能与其降低MMP-2、MMP-9 蛋白表达有关〔11，12〕。顾文燕等〔13〕发现，萝卜硫素可通过上调Bax 表达促使结肠癌SW480细胞凋亡，并增强5-氟尿嘧啶对癌细胞化疗耐受的能力。本研究结果提示在1～40 μmol/L 浓度范围内，萝卜硫素能显著抑制SW480 细胞增殖，能呈浓度依赖性降低SW480 细胞集落形成、侵袭、迁移能力。Ki-67、PCNA 均与细胞增殖活性相关，研究发现，下调结肠癌HT-29 细胞裸鼠皮下移植瘤组织细胞中PCNA、Ki-67 的表达，可抑制移植瘤细胞增殖〔14〕；MMP 能够降解细胞外基质和基底膜促进肿瘤细胞侵袭和迁移，研究发现，下调MMP-9 表达能够显著抑制结肠癌LoVo 细胞的迁移和侵袭能力〔15〕；E-cadherin 作为一种钙依赖性黏附分子，其表达缺失可降低细胞黏附能力、增强其分散能力，研究发现，结肠癌HCT116 细胞的转移受抑制可能与上调E-cadherin 表达相关〔16〕。本研究结果提示萝卜硫素能够通过下调Ki-67、PCNA、MMP-9 蛋白表达，上调E-cadherin 蛋白表达，进而抑制SW480 细胞增殖、侵袭和迁移，与既往研究结果类似〔14～16〕。

Notch 信号通路作为高度保守的信号转导途径，其异常激活与肿瘤细胞增殖、侵袭、转移密切相关，目前发现该通路存在Notch1、Notch2、Notch3、Notch4 4 个受体，Hes1 为其常见的经典下游基因。研究表明，抑制过度激活的Notch1/Hes1 信号通路可抑制HT29 和HCT116 细胞等结肠癌细胞生长〔17〕。高蕊等〔7〕在SW480 细胞中发现，芦丁可以通过抑制Notch1 与Hes1 介导的细胞增殖分化途径实现对结肠癌的治疗作用。Wang 等〔18〕发现MicroRNA-206 可通过靶向下调Notch3 表达，进而抑制结直肠癌SW480 和SW620 细胞增殖和迁移。本研究结果提示萝卜硫素能明显抑制Notch 信号通路相关受体Notch1、Notch3 及下游基因Hes-1 蛋白表达，抑制Notch 信号通路激活。