长链非编码RNA PRNCR1 通过靶向miR-126-5p 调控非小细胞肺癌增殖、迁移、侵袭的生物学特性

张萌 崔姚 李颖璐 王建新 吴宇翔 时沛

（南阳医学高等专科学校第一附属医院肿瘤科,河南 南阳 473000）

肺癌的发病率和死亡率在世界上均居首位，主要包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中80%以上为非小细胞肺癌〔1～3〕。临床上大部分患者确诊时已至ⅢB 和Ⅳ期，失去最佳治疗时机。长度超过200个核苷酸的LncRNA 及19～25 核苷酸的miRNA 为非编码RNA 的重要组成部分〔4～6〕。LncRNA 在人类肿瘤的调控中可通过多途径发挥作用，包括调节miRNA〔7，8〕。前列腺癌非编码RNA（PRNCR）1 位于染色体8q24，最早发现于前列腺癌〔9〕。少有研究报道PRNCR1 在非小细胞肺癌中的功能与机制。生物学预测出miR-126-5p 可能是PRNCR1 的靶标，而miR-126-5p 被报道在非小细胞肺癌组织和细胞系中低表达〔10〕。因此，本研究对PRNCR1、miR-126-5p在非小细胞肺癌细胞H1299 内的表达进行检测，并观察二者在H1299 细胞增殖、迁移和侵袭中的作用，揭示PRNCR1 的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 H1299 细胞、正常人支气管上皮细胞HBE 购自美国组织培养库（ATCC）；DMEM 培养基、四甲基偶氮唑蓝（MTT）购自美国Gibco 公司；LipofectamineTM2000、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒、逆转录试剂盒购自大连宝生物工程公司；聚偏氟乙烯（PVDF）膜购自德国Roche Diagnostics 公司；基质胶购自上海前尘生物公司；Transwell 小室购自美国Corning 公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胶凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂盒、电化学（ECL）发光液和RIPA 蛋白裂解液均购自江苏Beyotime Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 在37℃和5%CO2的恒温培养箱中，将非小细胞肺癌细胞H1299、正常人支气管上皮细胞HBE 与DMEM 培养基（10%胎牛血清）一起常规孵育。

1.2.2 细胞转染 将si-con 组（转染si-con）、si-PRNCR1 组（转染si-PRNCR1）、miR-130b-3p 组（转染miR-130b-3p mimics）、miR-NC 组（转染miRNC）、si-PRNCR1+anti-miR-NC 组（共转染si-PRNCR1 和anti-miR-NC）、si-PRNCR1+anti-miR-126-5p组（共转染si-PRNCR1 和anti-miR-126-5p），通过脂质体LipofectamineTM2000 试剂转染至H1299 细胞，采用实时荧光定量-聚合酶链反应（qRT-PCR）检测转染48 h 后的效率。

1.2.3 qRT-PCR 实验 应用RNA 抽提试剂盒，提取1.2.2 各组H1299 细胞RNA，并通过逆转录试剂盒进行cDNA 制备。最后通过qRT-PCR 试剂盒检测，采用2-△△Ct计算PRNCR1 和miR-126-5p 表达。

1.2.4 MTT 实验 将1.2.2 各组H1299 细胞与20 μl 5 g/L 的MTT 溶液反应4 h，以DMSO 溶解结晶，随后酶标仪记录 H1299 细胞的吸光度（OD490 nm）。

1.2.5 Transwell 小室 以无血清DMEM 培养基稀释1.2.2 各组H1299 细胞（105个/ml），在铺适量厚度的基质胶（检测侵袭）或不铺基质胶（检测迁移）的Transwell 上室添加100 μl H1299 细胞，下室添加600 μl含血清的DMEM 培养基，12 h 后取出小室，经甲醇固定30 min 和0.1%结晶紫染色20 min，将Transwell 小室下表面附着的侵袭或迁移细胞数于显微镜下观察，以5 个视野的平均值为侵袭或侵袭细胞数。

1.2.6 双荧光素酶报告基因检测实验PRNCR1 和miR-126-5p 构建野生型（WT）-PRNCR1（含PRNCR1 3＇UTR 片段）和突变型（MUT）-PRNCR1（含PRNCR1 3＇UTR 片段突变体）的荧光素酶报告载体，遵循LipofectamineTM2000 操作手册的指示，H1299细胞转染miR-126-5p、miR-NC 和WT-PRNCR1 记为miR-126-5p 组，H1299 细胞转染miR-126-5p、miRNC 和MUT-PRNCR1 记为miR-NC 组；利用美国Promega 公司的双荧光素酶报告基因检测试剂盒，记录转染24 h 后的萤火虫和海肾荧光素酶激发值，以萤火虫与海肾荧光素酶激发值之比评价PRNCR1 基因的激活程度。

1.3 统计学方法 采用SPSS21.0 软件进行单因素方差分析、t检验和SNK-q检验。

2 结果

2.1 PRNCR1 和miR-126-5p 在H1299 细胞和HBE细胞中的表达 H1299 组PRNCR1 表达水平（2.79±0.18）显著高于HBE 组（1.01±0.09，P＜0.05），H1299 组miR-126-5p 表达水 平（1.07 ±0.12）显著低于HBE 组（3.12±0.27，P＜0.05）。

2.2 抑制PRNCR1 表达对非小细胞肺癌H1299 细胞增殖的影响 si-PRNCR1 组H1299 细胞中PRNCR1 表达水平显著低于si-NC 组（P＜0.05），且48 h和72 h 时细胞活性显著低于si-NC 组（P＜0.05）。见表1。

表1 抑制PRNCR1 表达对非小细胞肺癌H1299细胞增殖的影响(,n=3)

表1 抑制PRNCR1 表达对非小细胞肺癌H1299细胞增殖的影响(,n=3)

图1 非小细胞肺癌H1299 细胞迁移、侵袭(结晶紫染色,×200)

2.3 抑制PRNCR1 表达对非小细胞肺癌H1299 细胞迁移、侵袭的影响 与si-NC 组相比，si-PRNCR1组H1299 细胞的迁移细胞数和侵袭细胞数均显著降低（P＜0.05）。见表2。

表2 抑制PRNCR1 表达对非小细胞肺癌H1299 细胞迁移、侵袭的影响(,n=3,个)

表2 抑制PRNCR1 表达对非小细胞肺癌H1299 细胞迁移、侵袭的影响(,n=3,个)

2.4 miR-126-5p 过表达对非小细胞肺癌H1299 细胞增殖、迁移、侵袭的影响 miR-126-5p 组H1299细胞中miR-126-5p 表达水平显著高于miR-NC 组（P＜0.05），48 h、72 h 时细胞活性、迁移细胞数和侵袭 细胞数均显著低于miR-NC 组（P＜0.05）。见表3。

表3 miR-126-5p 过表达对非小细胞肺癌H1299 细胞增殖、迁移、侵袭的影响(,n=3)

表3 miR-126-5p 过表达对非小细胞肺癌H1299 细胞增殖、迁移、侵袭的影响(,n=3)

2.5 PRNCR1 靶向调控miR-126-5p 的表达 miRcode 数据库预测结果见图2，PRNCR1 3＇UTR 部分核苷酸序列可与miR-126-5p 互补配对；miR-15a 组WT-PRNCR1 荧光活性比miR-NC 组显著降低（P＜0.05），转染miR-15a 或miR-NC 对MUT-PRNCR1细胞中荧光活性无显著影响（P＞0.05）。见表4。si-PRNCR1 组细胞中miR-126-5p 表达（2.77±0.23）是si-NC 组（1.04±0.09）的约1.66 倍，pcDNA-PRNCR1 组细胞中miR-126-5p 表达（0.53±0.06）是pcDNA 组（1.12±0.11）的约0.47 倍，均有统计学意义（P＜0.05）。

表4 双荧光素酶报告实验(,n=3)

表4 双荧光素酶报告实验(,n=3)

图2 PRNCR1 的3′UTR 中含有与miR-126-5p 互补的核苷酸序列

2.6 抑制miR-126-5p 表达逆转了抑制PRNCR1 表达对非小细胞肺癌H1299 细胞增殖、迁移、侵袭的作用 si-PRNCR1+anti-miR-126-5p 组48、72 h 时细胞活性、迁移细胞数和侵袭细胞数显著高于si-PRNCR1+anti-miR-NC 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表5。

表5 抑制miR-126-5p 表达逆转了抑制PRNCR1 表达对非小细胞肺癌H1299 细胞增殖、迁移、侵袭的作用(,n=3)

表5 抑制miR-126-5p 表达逆转了抑制PRNCR1 表达对非小细胞肺癌H1299 细胞增殖、迁移、侵袭的作用(,n=3)

3 讨论

LncRNA 与miRNA 之间的相互作用关系在肿瘤的发生发展中发挥关键作用。Chung 等〔11〕报道，rs1456315 和rs7463708 之间（chr8:128，173，119～128，173，237 bp）区域被转录为13 kb 无内含子非编码RNA（ncRNA），称为PRNCR1（前列腺癌非编码RNA1）。Yang 等〔12〕发现，PRNCR1 在大多数结直肠癌细胞中上调，敲低PRNCR1 后，结直肠癌细胞增殖能力被显著抑制，进一步发现PRNCR1 敲低诱导细胞周期停滞在G0/G1 期且S 期细胞比例显著降低，相反，PRNCR1 敲低不影响细胞凋亡或侵袭能力，这些数据表明PRNCR1 促进结直肠癌细胞的增殖，且是结直肠癌的潜在致癌基因。Dezhi 等〔13〕发现，miR-448 在非小细胞肺癌组织和细胞中表达升高，通过抑制细胞增殖、侵袭、迁移和上皮-间质转化（EMT）揭示了miR-448 在非小细胞肺癌中的抗癌基因功能，发现miR-448 被LncRNA PRNCR1 负调节，此外，HEY2（与YRPW 基序蛋白2 分开相关的毛发和增强子）被证明是非小细胞肺癌细胞中miR-448 的靶mRNA，所有机制实验均显示LncRNA PRNCR1 通过调节miR-448 和HEY2 在非小细胞肺癌中发挥ceRNA 功能。

研究报道，miR-126 在各种肺癌中均发挥抑癌基因的作用，尤其非小细胞肺癌〔14～16〕。Liu 等〔17〕报道，miR-126-3p 在非小细胞肺癌细胞系和组织中显著下调，miR-126-3p 的上调抑制了非小细胞肺癌细胞的生长、集落形成、迁移和侵袭，此外，异种移植模型表明miR-126-3p 通过靶向趋化因子（C-C 基序）受体（CCR）1 抑制非小细胞肺癌细胞生长和肺转移，又证实了CCR1 过表达挽救了miR-126-3p 对非小细胞肺癌细胞生长，迁移和侵袭的抑制作用，最后，CCR1 的敲除能够模拟miR-126-3p 对非小细胞肺癌细胞进展的抑制作用，表明miR-126-3p 通过靶向CCR1 在非小细胞肺癌的生长、迁移和侵袭中起重要作用。