白芍总苷通过ERK 信号通路抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和诱导细胞凋亡

马新苹 党长林

（1 新乡市中心医院皮肤性病科,河南 新乡 453000;2 新乡医学院第一附属医院成人康复科）

瘢痕疙瘩是一种良性皮肤肿瘤，以成纤维细胞的过度增殖、胶原蛋白和纤连蛋白的过量沉积为特征，是创伤愈合最常见的病理形式〔1〕。其发生发展不仅影响皮肤美观，常伴有疼痛、瘙痒症状，甚至造成严重的功能损害，对患者危害极大。此外，瘢痕疙瘩术后复发率高，术后畸形较多，单纯手术切除难以治愈〔2，3〕。白芍是临床常用中草药之一，具有平肝止痛、养血调经、敛阴止汗等功效。白芍总苷（TGP）是白芍的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、免疫调节和镇痛作用。此外，TGP 通过调控滑膜成纤维细胞的增殖和凋亡对骨关节炎具有治疗作用〔4〕。细胞外信号调节激酶（ERK）是丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）信号通路的一部分，研究显示〔5，6〕，ERK 的磷酸化调节成纤维细胞分化，ERK 通路的异常激活与病理性瘢痕的形成有关。但TGP 能否通过调控ERK 信号通路进而影响瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖和凋亡尚未可知。目前，尚未见TGP 与瘢痕疙瘩的相关报道。本研究观察不同浓度的TGP 对体外培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞（HKF）增殖、纤维化、凋亡及ERK 信号通路的影响，探索其分子机制，为瘢痕疙瘩的治疗开辟新的途径。

1 材料与方法

1.1 实验材料 HKF 购于中科院上海细胞库；（DMEM）培养基、胎牛血清购于美国Gibco 公司；TGP（纯度≥98%）购于南京泽朗医药科技有限公司；MAPK/ERK 信号通路激活剂（ISO）购于MEC 公司；噻唑蓝（MTT）细胞增殖检测试剂盒和膜联蛋白异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）细胞凋亡检测试剂盒购于北京索莱宝生物科技有限公司；Western 封闭液、Western 洗涤液、放射免疫沉淀测定（RIPA）裂解液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒购于上海碧云天公司；鼠源Ⅰ型胶原蛋白α1链（Col1A1）单克隆抗体和鼠源Col3A1 单克隆抗体购于Santa Cruz 公司；兔源α-平滑肌肌动蛋白（SMA）多克隆抗体、兔源B 细胞淋巴瘤（Bcl）-2 单克隆抗体、兔源Bcl 相关X 蛋白（Bax）多克隆抗体、兔源Caspase-3 多克隆抗体、鼠源ERK1/2 单克隆抗体购于Abcam 公司；兔源p-ERK1/2 多克隆抗体购于Invitrogen 公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠和羊抗兔Ⅱ抗购于武汉博士德公司。

1.2 细胞培养和分组 采用含有10%胎牛血清的DMEM 培养基在37℃，含5% CO2培养箱中培养HKF，每隔2 d 换液1 次，当细胞密度达到80%～90%时，即传代培养，取3～5 代对数期细胞用于后续实验。细胞分组为对照组:不用TGP 处理；实验组:分别用含5、10、20、40、80 μmol/L TGP 浓度的培养液进行培养。为进一步证实TGP 是通过调控ERK 信号通路进而调控HKF 的增殖和凋亡，使用40 μmol/L TGP 处理HKF 后，加入ISO（20 μmol/L）〔7〕，检测细胞的增殖、凋亡和纤维化情况。

1.3 MTT 法检测细胞增殖活力 将HKF 按照每孔1×104个细胞数接种于96 孔板过夜，用不含血清培养基培养12 h，以含5、10、20、40、80 μmol/L 浓度梯度的TGP 的培养基进行培养，每组浓度加入设置3个复孔，同时设置对照组（不加TGP）分别在培养24、48、72 h 时间点进行细胞活力检测。向每孔内加入20 μl 的MTT（5 g/L）溶液，培养箱内培养细胞4 h，弃去孔内培养液，再向每孔加入150 μl 二甲基亚砜（DMSO），摇床振荡10 min，当结晶物充分溶解后，在酶标仪上测490 nm 波长处各孔的吸光度值（用空白孔调零），计算细胞存活率。细胞存活率=实验组平均OD 值/对照组平均OD 值×100%。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡 将HKF 按照每孔1×104个细胞数接种于96 孔板过夜，用不含血清培养基培养12 h，用含10、20、40 μmol/L 的TGP 培养基进行培养，每组浓度加入设置3 个复孔，同时设置对照组（不加TGP）。48 h 后，收集各组细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，随后用1×结合缓冲液洗涤细胞，离心后弃上清。加入适量的1×结合缓冲液悬浮细胞，调整细胞浓度，取100 μl 细胞悬液（细胞数约为1×105个）加入流式管，随后加入5 μl Annexin V-FITC，混匀后避光孵育10 min，加入5 μl PI，继续孵育5 min 后，补加PBS 液至500 μl，混匀后1 h 内上机检测细胞凋亡情况。

1.5 Western 印迹检测 采用Western 印迹检测各组HKF 纤维化相关蛋白、凋亡相关蛋白、ERK 信号通路相关蛋白的表达水平。用RIPA 裂解法提取各组对数期细胞的总蛋白，BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取30 μg 细胞蛋白，煮沸3 min 使其充分变性后，上样至十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）加样孔及耐性电泳，电泳结束后，将已分离的细胞蛋白转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，随后用Western 封闭液室温条件封闭1 h，Western 洗涤液洗膜后，加入已稀释的一抗4℃孵育过夜，Western 洗涤液洗膜后，加入相应二抗室温孵育2 h，再次用Western 洗涤液洗膜后，超敏电化学发光（ECL）试剂盒显色，凝胶成像系统拍照，随后以βactin 为内参，利用Photoshop CS5 软件分析条带灰度值。

1.6 统计学方法 采用SPSS21.0 软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结果

2.1 不同浓度TGP 对HKF 增殖的影响 不同浓度TGP 对HKF 分别作用24 h、48 h、72 h 后，较高浓度（20、40、80 μmol/L）的TGP 对HKF 增殖具有显著的抑制作用，与同时间点对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。随着TGP 浓度的降低，对HKF 的抑制作用逐渐减弱，较低浓度（5 μmol/L）的TGP 对HKF 增殖具有轻度的促进作用，且同一浓度下，随着干预时间的延长抑制或促进作用逐渐升高，呈时间依赖性。见表1。

表1 不同浓度TGP 对HKF 增殖的影响(,n=9)

表1 不同浓度TGP 对HKF 增殖的影响(,n=9)

与对照组比较:1）P＜0.05，表2，3 同

2.2 不同浓度TGP 对HKF 纤维化标记表达的影响 与对 照组比较，10 μmol/L TGP 组 HKF Col1A1、Col3A1、α-SMA 表达水平无显著变化（P＞0.05），20、40 μmol/L TGP 组HKF Col1A1、Col3A1、α-SMA 表达水平显著降低，且呈浓度依赖性（P＜0.05）。见图1、表2。

图1 Western 印迹检测HKF Col1A1、Col3A1 及α-SMA 的表达

2.3 不同浓度TGP 对HKF 凋亡的影响 10 μmol/L TGP 组HKF Bax、Caspase-3、Bcl-2 的表达水平及细胞凋亡率无显著变化（P＞0.05）。20、40 μmol/L TGP 组HKF Bax 和Caspase-3 表达水平显著升高，Bcl-2 表达水平显著降低，细胞凋亡率显著升高，且呈浓度依赖性（P＜0.05）。见表2、图2。

图2 流式细胞术检测HKF 凋亡和Western 印迹检测Bax、Caspase-3 和Bcl-2 蛋白的表达

表2 不同浓度TGP 对HKF Col1A1、Col3A1、α-SMA 及凋亡相关蛋白和凋亡率的影响(,n=9)

表2 不同浓度TGP 对HKF Col1A1、Col3A1、α-SMA 及凋亡相关蛋白和凋亡率的影响(,n=9)

2.4 不同浓度TGP 对HKF ERK 信号通路的影响 与对照组比较，10 μmol/L TGP 组HKF ERK 信号通路相关蛋白p-ERK1/2 和ERK1/2 的表达水平无明显变化（P＞0.05），20、40 μmol/L TGP 组HKF ERK 信号通路相关蛋白p-ERK1/2 和ERK1/2 的表达水平显著降低（P＜0.05）。见图3、表3。

图3 Western 印迹检测p-ERK1/2 和ERK1/2 蛋白的表达

表3 不同浓度TGP 对HKF ERK 信号通路的影响(,n=9)

表3 不同浓度TGP 对HKF ERK 信号通路的影响(,n=9)

2.5 ISO 逆转TGP 对HKF 的增殖和凋亡的影响 与对照组比较，TGP 组HKF Bax 和Caspase-3 表达水平显著升高，Bcl-2、Col1A1、Col3A1、α-SMA、p-ERK1/2 及ERK1/2 的表达水平显著降低，细胞增殖率显著降低，细胞凋亡率显著升高；与TGP 组比较，TGP+ISO 组HKF Bax 和Caspase-3 表达水平显著降低，Bcl-2、Col1A1、Col3A1、α-SMA、p-ERK1/2及ERK1/2 的表达水平显著升高，细胞增殖率显著升高，细胞凋亡率显著降低（均P＜0.05）。提示激活ERK 信号通路能逆转TGP 对HKF 增殖、凋亡和纤维化的影响，见图4、表4、表5。

表4 ISO 和TGP 对HKF 增殖、凋亡相关蛋白和凋亡率的影响(,n=9)

表4 ISO 和TGP 对HKF 增殖、凋亡相关蛋白和凋亡率的影响(,n=9)

与对照组比较:1）P＜0.05；与TGP 组比较:2）P＜0.05；表5 同

表5 ISO 和TGP 对HKF 纤维化标记表达和ERK 信号通路的影响(,n=9)

表5 ISO 和TGP 对HKF 纤维化标记表达和ERK 信号通路的影响(,n=9)

图4 Western 印迹检测HKF 蛋白表达

3 讨论

HKF 具有肿瘤样细胞特性，其异常增殖活动和胶原蛋白的过度合成导致的持续性组织纤维化是皮肤瘢痕的常见表现。目前，虽然瘢痕疙瘩的治疗方法多种多样，但仍存在不良反应高、复发频繁的风险〔8〕。因此，探索对HKF 过度增殖的干预药物对研究和治疗瘢痕疙瘩具有重大意义。

TGP 是从白芍根中提取的具有生物活性的化合物。主要由5 种单萜苷组成，包括芍药苷、羟芍药苷、甲基花青苷、白化素和苯甲酰芍药苷。芍药苷含量最高，占TGP 活性成分的90%。自1998 年TGP被国家食品药品监督管理局批准用于治疗类风湿关节炎〔9〕，随后又被广泛用于系统性红斑狼疮〔10〕和干燥综合征〔11〕的治疗。研究显示〔12〕，TGP 通过上调Samd7 表达，抑制转化生长因子（TGF）-β1 表达，能减轻皮肤的纤维化，可有效缓解硬皮病皮肤硬化程度；TGP 可显著防止大鼠肝纤维化，具有潜在的肝保护作用；此外，TGP 通过延长G2 期，阻滞S 期进而抑制滑膜成纤维细胞过度增殖对骨性关节炎具有治疗作用〔13〕。以上研究发现是临床应用TGP 治疗瘢痕疙瘩的基础。

本研究与王欢等〔13〕研究发现TGP 对滑膜成纤维细胞的双重作用类似。瘢痕疙瘩的发病机制与成纤维细胞异常活动和组织纤维化有关〔14〕，抑制HKF的增殖和胶原的合成，促进细胞凋亡是抑制瘢痕形成的关键。MAPK/ERK 信号通路参与正常创面愈合和致病性纤维化，研究表明〔15～18〕，ERK 磷酸化在瘢痕疙瘩组织和成纤维细胞中显著增加，干预ERK信号通路转导可抑制HKF 增殖，并促进凋亡，抑制胶原合成。因此，推测较高浓度TGP 通过抑制ERK信号通路活化进而抑制HKF 增殖、纤维化，促进细胞凋亡。

综上，较高浓度的TGP 能抑制HKF 增殖，诱导细胞凋亡，其机制与抑制ERK 信号通路有关。因此，TGP 具有治疗瘢痕疙瘩的潜在价值。