miR-335-5p 通过靶向调控GRK4 对ox-LDL 诱导的血管平滑肌细胞损伤的影响及其机制

黄威 饶艳玲 （ 武汉市第三医院老年病科,湖北 武汉 430060; 武汉市第五医院中医科）

血管平滑肌细胞（VSMCs）是血管壁的主要组成细胞，通过舒张和收缩改变血管直径使血管保持适当血压，VSMCs 的衰老和DNA 氧化损伤是导致动脉粥样硬化（AS）的重要因素，AS 又是导致大多数心脏病和脑卒中的主要原因〔1，2〕。氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）主要由活性氧（ROS）生成增多并氧化修饰LDL 产生，可与多种受体结合造成脂质聚积，形成泡沫细胞，还具有损伤血管内皮细胞、促进VSMCs 增殖、迁移及炎性细胞因子释放等作用，参与、促进了AS 的发生和发展〔3〕。近年来发现miRNAs 参与心血管生理、病理过程的调控并且通过调节血管活性分子、细胞因子等调节VSMC 细胞的功能，在血管损伤、重塑相关疾病中具有重要调节作用，是心血管疾病中的重要调控因子〔4〕。miR-335-5p 在败血症小鼠模型中表达下调，过表达的miR-335-5p 通过激活腺苷单磷酸激活蛋白激酶（AMPK）/自噬激活激酶（ULK）1 信号通路靶向脂肪酸合成酶（FASN）调节内皮细胞中的促凋亡因子和抗细胞凋亡因子，促进自噬，减少细胞凋亡，促进内皮细胞进入细胞周期，从而减轻脓毒症小鼠模型的炎症反应〔5〕。G 蛋白耦联受体激酶（GRK）4 属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族，可通过调节膜蛋白受体而发挥多种生物学作用，研究发现GRK4 与VSMC 的功能调节有关，GRK4 在ox-LDL 刺激的VSMC 中高表达，干扰GRK4，平滑肌细胞增殖减弱〔6〕。但miR-335-5p 对ox-LDL 诱导的VSMCs 损伤的影响及是否用过调控GRK4 影响平滑肌细胞损伤还尚未清楚。本实验旨在研究miR-335-5p 对ox-LDL 诱导的VSMCs 损伤的作用及其机制，为AS 的预防和治疗提供新思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人主动脉血管平滑肌细胞HA-VSMC购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清、DMEM 培养基、胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、二喹啉甲酸（BCA）试剂盒、磷酸盐缓冲液（PBS）购自美国Sigma公司；ox-LDL 购自北京索莱宝科技有限公司；LipofectamineTM2000 转染试剂盒购自美国Invitrogen 公司；Trizol 试剂、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa 公司；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）和碘化丙锭（PI）试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京Solarbio 公司；抗体均购自上海煊翎生物科技有限公司；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒购自上海联科生物技术有限公司；RIPA 蛋白裂解液、聚偏氟乙烯（PVDF）膜、十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组 使用含10% 胎牛血清的DMEM 培养基于37℃、5% CO2条件下培养HAVSMC，每天换液一次，将融合至80%左右的细胞适量胰酶消化并重悬细胞，调整浓度为5×105个/ml，取100 μl 接种至96 孔板，加入终浓度为50 mg/ml的ox-LDL，然后在37℃、5% CO2条件下培养48 h，收集细胞备用，作为ox-LDL 处理组，以不添加ox-LDL 培养的细胞作为对照（Con）组。将miR-NC、miR-335-5p、anti-miR-NC、anti-miR-335-5p 分别转染至未经任何处理的HA-VSMC 细胞中，记为miR-NC组、miR-335-5p 组、anti-miR-NC 组、anti-miR-335-5p组。用含50 mg/ml ox-LDL、5% 胎牛血清的DEME培养基培养HA-VSMC 细胞1 h，然后按照Lipofectamine 转染试剂说明书将miR-NC、miR-335-5p、si-NC、si-GRK4 质粒分别转染至HA-VSMC 细胞中再培养24 h，分别记为ox-LDL+miR-NC 组、ox-LDL+miR-335-5p 组、ox-LDL+si-NC 组、ox-LDL+si-GRK4组。将miR-335-5p 分别与pcDNA、pcDNA-GRK4 共转染至ox-LDL 处理的细胞中再培养24 h，分别记为ox-LDL+miR-335-5p+pcDNA 组、ox-LDL+miR-335-5p+pcDNA-GRK4 组。每组设3 个重复。

1.2.2 qRT-PCR 检测miR-335-5p 和GRK4 mRNA表达水平 提取总RNA，微量核酸测定仪检测RNA纯度和浓度。使用TaKaRa 反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，按照TaKaRa 荧光定量试剂盒使用说明配制反应体系，以β-actin 为内参进行PCR 扩增，每个样品设3 个复孔，循环条件为95℃30 s，60℃30 s；72℃30 s，共40 个循环；72℃延长5 min。相对表达量采用2-△△Ct法计算。

1.2.3 Western 印迹检测蛋白表达 收集各组细胞，加入RIPA 裂解液裂解，4℃，10 000 r/min 离心15 min，收集蛋白上清液，BCA 试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样品进行SDS-PAGE 后转至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭液室温封闭1 h。分别加入一抗（1 ∶1 000），4℃孵育过夜，TBST洗膜；加入二抗（1 ∶2 000）室温孵育2 h，TBST洗涤3 次，每次10 min，后在暗室中曝光显影，再浸入定影，最后洗去残液晾干，将胶片用Quantity One 凝胶分析软件处理，测定各组蛋白条带的吸光度，以目的条带和GAPDH 条带的比值作为蛋白表达水平。每个蛋白样品重复3 次。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化各组细胞，离心收集各组细胞，PBS 漂洗2 次，加结合缓冲液重悬细胞。依据试剂盒说明书，先后加入Annexin V-FITC 和PI 避光孵育15 min。流式细胞仪检测激发波长488 nm和发射波长530 nm 处的荧光强度。实验重复3 次。

1.2.5 ELISA 检测白细胞介素（IL）-1β 和肿瘤坏死因子（TNF）-α 的表达 取各组细胞，离心取上清，然后按照ELISA 试剂盒说明书进行检测。

1.2.6 荧光素酶报告基因检测实验检测miR-335-5p 对GRK4 的靶向调控 TargetScan 数据库显示GRK4 3＇UTR 区域有miR-335-5p 结合位点。构建野生型和突变型基因靶点GRK4 的3＇UTR-荧光素酶表达载体（WT-GRK4 和MUT-GRK4），取对数生长期血管平滑肌细胞接种于24 孔板（5×104个/孔），待细胞生长至80%融合时，用LipofectamineTM2000将WT-GRK4 和MUT-GRK4 组细胞分别转染miRNC 和miR-335-5p。依据说明书要求，使用荧光素酶报告基因检测仪进行双荧光素酶报告实验测定。实验结果以荧光素酶活性和Renilla 活性的比值进行统计学分析。实验重复3 次。

1.3 统计学分析 采用SPSS20.0 软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结果

2.1 ox-LDL 处理对HA-VSMC 细胞中miR-335-5p和GRK4 表达的影响 与Con 组相比，ox-LDL 组细胞中miR-335-5p 的表达水平显著降低，GRK4 mRNA 及蛋白的表达水平显著升高（均P＜0.001）。见图1，表1。

表1 ox-LDL 处理对HA-VSMC 细胞中miR-335-5p 和GRK4 表达的影响(,n=9)

表1 ox-LDL 处理对HA-VSMC 细胞中miR-335-5p 和GRK4 表达的影响(,n=9)

图1 GRK4 蛋白表达

2.2 miR-335-5p 过表达对ox-LDL 诱导的HA-VSMC细胞炎症因子表达的影响 与Con 组相比，ox-LDL组miR-335-5p 的表达水平显著降低；与ox-LDL+miRNC 组相比，ox-LDL+miR-335-5p 组miR-335-5p 的表达水平显著升高（P＜0.05）。与Con 组相比，ox-LDL组IL-1β 和TNF-α 的表达水平显著升高；与ox-LDL+miR-NC 组相比，ox-LDL+miR-335-5p 组IL-1β 和TNF-α 的表达水平显著降低（P＜0.05）。见表2。

表2 miR-335-5p 过表达对ox-LDL 诱导的HA-VSMC 细胞炎症因子表达及凋亡的影响(,n=9)

表2 miR-335-5p 过表达对ox-LDL 诱导的HA-VSMC 细胞炎症因子表达及凋亡的影响(,n=9)

与Con 组比较:1）P＜0.05；与ox-LDL+miR-NC 组比较:2）P＜0.05

2.3 miR-335-5p 过表达对ox-LDL 诱导的HAVSMC 细胞凋亡的影响 与Con 组相比，ox-LDL 组Bcl-2 表达水平及凋亡率显著降低，Bax、cleavedcaspase3 表达水平显著升高；与ox-LDL+miR-NC 组相比，ox-LDL+miR-335-5p 组Bcl-2 表达水平显著升高，Bax、cleaved-caspase3 表达水平及凋亡率显著降低（P＜0.05）。见图2、表2、图3。

图2 凋亡相关蛋白表达

图3 细胞凋亡流式图

2.4 抑制GRK4 表达对ox-LDL 诱导的HA-VSMC细胞损伤的影响 与ox-LDL+si-NC 组相比，ox-LDL+si-GRK4 组Bcl-2 表达水平显著升高，Bax、cleaved-caspase3、GRK4 表达水平、细胞凋亡率、IL-1β、IFNα 水平均显著降低（P＜0.05）。见表3、图4。

图4 GRK4 和凋亡相关蛋白的表达

表3 抑制GRK4 表达对ox-LDL 诱导的HA-VSMC 细胞损伤的影响(,n=9)

表3 抑制GRK4 表达对ox-LDL 诱导的HA-VSMC 细胞损伤的影响(,n=9)

与Con 组比较:1）P＜0.05；与ox-LDL+si-NC 组比较:2）P＜0.05

2.5 miR-335-5p 靶向调控GRK4 的表达 通过TargetScan 数据库预测到GRK4 与miR-335-5p 存在结合位点（图5）。荧光素酶报告基因检测实验结果（表4）显示，相较于miR-NC 组，miR-335-5p 组WTGRK4 荧光素酶活性显著降低（P＜0.05）；MUTGRK4 荧光素酶活性差异不显著。相较于miR-NC组，miR-335-5p GRK4 蛋白的表达水平显著降低（0.46±0.04 vs 0.23±0.02，P＜0.05）；相较于antimiR-NC 组，miR-335-5p 组GRK4 蛋白的表达水平显著升高（0.44±0.04 vs 0.94±0.08，P＜0.05）。见图6。

表4 双荧光素酶报告实验(,n=9)

表4 双荧光素酶报告实验(,n=9)

图5 GRK4 的3′UTR 中含有与miR-335-5p 互补的核苷酸序列

图6 GRK4 蛋白表达

2.6 GRK4 过表达逆转了miR-335-5p 过表达对ox-LDL 诱导的HA-VSMC 细胞损伤的作用 与ox-LDL+miR-335-5p+pcDNA 组相比，ox-LDL+miR-335-5p+pcDNA-GRK4 组Bcl-2 表达水平显著降低，Bax、cleaved-caspase3、GRK4 表达水平、凋亡率、IL-1β、TNF-α 水平均显著升高（P＜0.05）。见图7、表5。

图7 GRK4 和凋亡相关蛋白的表达

表5 GRK4 过表达逆转了miR-335-5p 过表达对ox-LDL 诱导的HA-VSMC 细胞损伤的作用(,n=9)

表5 GRK4 过表达逆转了miR-335-5p 过表达对ox-LDL 诱导的HA-VSMC 细胞损伤的作用(,n=9)

与ox-LDL+miR-NC 组比较:1）P＜0.05；与ox-LDL+miR-335-5p+pcDNA 组比较:2）P＜0.05

3 讨论

内皮细胞损伤等所导致的分泌功能失调和平滑肌细胞的异常增殖而引起的血管腔狭窄和痉挛是多种血管疾病发生发展的共同病理基础〔7〕；AS 是一种脂质代谢与炎症性血管疾病，炎症在AS 发生发展中的作用越来越受到广泛关注，有报道发现ox-LDL可以通过触发炎症反应，促进AS 的发生、形成〔8〕。TNF-α 和IL-1β 是与AS 有关的炎性细胞因子，能够促进血管炎症发生〔9〕。研究发现促炎因子IL-1β 和TNF-α 在ox-LDL 诱导的VSMCs 中mRNA 水平大大提高，苦参碱在抑制它们的表达后抑制了VSMCs 增殖和凋亡〔10〕。TNF-α 和IL-1β 下调表达，可减弱炎症反应，延缓慢性牙周炎发展〔11〕。本研究结果显示在ox-LDL 诱导的血管平滑肌细胞中TNF-α 和IL-1β 下均高表达，ox-LDL 促进VSMC 细胞的凋亡。而VSMC的凋亡和增殖失衡促进AS 的发生发展〔12〕。

miRNA 参与调控血脂代谢、血管炎症、血管内皮细胞及VSMCs 与AS 发病机制相关〔13〕。研究表明，miR-335-5p 在骨关节炎患者的外周血单核细胞中下调表达，可能是骨关节炎的保护基因〔14〕。高糖状态下，miR-335-5p 表达水平下调，高表达通过抑制DKK1 的蛋白表达，从而促进MC3T3-E1 成骨细胞的增殖，抑制细胞凋亡〔15〕。本研究发现在ox-LDL 诱导的血管平滑肌细胞中miR-335-5p 低表达，过表达miR-335-5p 炎症因子TNF-α、IL-1β 释放减少，细胞凋亡率降低。说明过表达miR-335-5p 可保护ox-LDL 诱导的血管平滑肌细胞损伤。

GRK4 是GRK 家族的一员，广泛存在于各种组织，能特异地磷酸化G 蛋白耦联受体（GPCRs）使其脱敏，从而使受体介导的信号转导效应消失或者降低，且还能介导炎性介质所致细胞损伤的信号转导作用，GRKs 磷酸化GPCR 在炎症诱导细胞损伤过程中起一定调控作用〔16〕。GRK4 通过对内皮素B 型受体的异常调节，参与了原发性高血压发生与发病〔17〕。GRK4 还可以诱导细胞衰老〔18〕。GRK4 能够调控大鼠胸主动脉平滑肌细胞AT 受体蛋白表达及其磷酸化状态，影响心血管相关疾病〔19〕。GRK4上调肾脏AT1 受体表达，增加了肾脏氧化应激水平和肾小管细胞凋亡，加重了肾脏缺血再灌注损伤〔20〕。本研究中ox-LDL 能促进HA-VSMC 细胞中GRK4 表达，抑制表达GRK4 炎症因子TNF-α、IL-1β释放减少，细胞凋亡率降低。说明且GRK4 低表达可以保护ox-LDL 引起的血管平滑肌细胞损伤。且本研究还发现miR-335-5p 靶向调控GRK4 的表达，GRK4 过表达逆转了miR-335-5p 过表达对ox-LDL诱导的HA-VSMC 细胞损伤的作用。提示，miR-335-5p可能通过调控GRK4 进而影响炎性因子TNF-α、IL-1β的表达而发挥保护血管平滑肌细胞损伤的作用。

综上所述，miR-335-5p 通过抑制GRK4 的表达和TNF-α、IL-1β 的分泌对ox-LDL 能够诱导HAVSMC 细胞损伤发挥保护作用。可为AS 及VSMCs损伤导致的相关心血管疾病的预防和治疗提供新思路和新靶点。