LncRNA SNHG14 通过靶向miR-16-5p 对高糖诱导的小鼠肾脏足细胞损伤的影响

高慧祯 李凤丽 李蕾 康志强 （郑州大学附属郑州中心医院内分泌科,河南 郑州 450007）

糖尿病肾病是糖尿病的常见并发症之一，临床特征主要表现为持续性蛋白尿〔1〕。足细胞是维持肾小球滤过膜正常功能的主要成分，其损伤后可导致滤过膜电荷和孔径屏障破坏，形成蛋白尿〔2〕。高糖（HG）是诱导足细胞凋亡、损伤足细胞的一个重要因素〔3〕，探讨影响HG 诱导足细胞损伤的分子机制可为糖尿病肾病的治疗提供一定的新思路。长链非编码（Lnc）RNA 是一类长度超过200 个核苷酸的非编码RNA、在糖尿病、自身免疫、肿瘤等疾病中发挥重要 调控作 用〔4～6〕。小核仁RNA 宿主基 因（SNHG）14 是近年来在肿瘤中研究较多的一种LncRNA，其参与调控肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为〔7～9〕。研究还显示，SNHG14 与心脑血管疾病、炎症等发生发展密切相关〔10〕。但目前，SNHG14 在糖尿病肾病中的作用还未知。本研究主要探讨SNHG14 对HG 诱导的小鼠肾脏足细胞MPC5 损伤的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂 小鼠肾脏足细胞系MPC5，赛百慷（上海）生物技术股份有限公司；胎牛血清（FBS），浙江天杭生物科技有限公司；D-葡萄糖，美国Gibco公司；LipofectamineTM2000 试剂盒，美国Invitrogen公司；Trizol 试剂、逆转录试剂盒和聚合酶链反应（PCR）试剂盒，日本Takara 公司；B 细胞淋巴瘤（Bcl）-2、Bcl-2 相关X 蛋白（Bax）和酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）-3 抗体，中国Abcam 公司；nephrin、podocin 和synaptopodin 抗体，美国Maine 公司；SNHG14 的小干扰RNNA（si-NHG14）及过表达载体（pcDNA-SNHG14）、小干扰RNNA 阴性序列（si-NC）、空载体（pcDNA）、miR-16-5p 模拟物（mimic）及抑制剂（anti-miR-16-5p）、模拟对照序列（miR-NC）及抑制剂对照序列（anti-miRNC），上海吉凯基因公司；PCR 引物序列，上海生工生物工程股份有限公司；RPMI1640 培养基、Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒和二喹啉甲酸（BCA）蛋白测定试剂盒，北京索莱宝公司；双荧光素酶活性检测试剂盒，美国Promega 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养和转染 复苏MPC5 细胞后，用含10% FBS 的RPMI1640 培养基、置于37℃、CO2体积分数5%、湿度97%的培养箱中培养。当细胞融合至80%～90% 时，用0.25% 胰蛋白酶消化，传代培养。

1.2.2 qRT-PCR 检测SNHG14 和miR-16-5p 表达 培养结束后，Trizol 试剂提取细胞中总RNA，微量核酸仪检测RNA 的纯度和浓度后，逆转录为cDNA。以cDNA 为模板，行PCR 扩增。PCR 扩增程序:95℃5 min，95℃10 s，60℃30 s，72℃30 s，共进行35 个循环。引物序列:SNHG14 上游5＇-GGGTGTTTACGTAGACCAGAACC-3＇，下游5＇-CTTCCAAAAGC CTTCTGCCTTAG-3＇；miR-16-5p 上游5＇-CTCGCTAGCAGCACGTAAATA-3＇，下 游 5＇-TCCAGTGCAGGG TCCGAGGT-3＇；GAPDH 上 游5＇-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3＇，下 游5＇-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3＇；U6 上游5＇-CTCGCTTCGGCAGCACA-3＇，下游5＇-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3＇。SNHG14 以GAPDH 为内参，miR-16-5p 以U6 为内参，用2-ΔΔCt法计算SNHG14 和miR-16-5p 的相对表达量。

1.2.3 双荧光素酶报告基因实验验证SNHG14 与miR-16-5p 靶向关系 取2.5 ml 对数期MPC5 细胞（2.5×104个/ml）接种于6 孔板中，培养12 h 后，弃培养基，换为不含FBS 的RPMI1640 培养基。利用LipofectamineTM2000 试剂盒，分别将miR-16-5p 与WT-SNHG14、miR-NC 与WT-SNHG14、miR-16-5p 与MUT-SNHG14、miR-NC 与MUT-SNHG14 共转染至MPC5 细胞。分为miR-16-5p+WT-SNHG14 组、miRNC+WT-SNHG14 组、miR-16-5p+MUT-SNHG14 组、miR-NC+MUT-SNHG14 组。转染后12 h，更换为完全培养基，再培养48 h，弃培养基。加细胞裂解液裂解细胞，4℃、12 000 r/min 离心10 min，取上清液，利用双荧光素酶活性检测试剂盒检测荧光素酶活性，结果以萤火虫与海参的荧光强度的比值表示。

1.2.4 细胞转染 取2.5 ml 对数期MPC5 细胞（2.5×104个/ml）接种于6 孔板中，培养24 h 后，弃培养基，换为不含FBS 的RPMI1640 培养基。利用LipofectamineTM2000 试剂盒，分别转染si-SNHG14、si-NC、pcDNA-SNHG14、pcDNA、miR-16-5p mimics、miR-NC、si-SNHG14+anti-miR-16-5p、si-SNHG14+anti-NC 至MPC5 细胞。转染后12 h，更换为完全培养基，再培养48 h，qRT-PCR 检测SNHG14 或miR-16-5p 水平验证转染效果，方法同1.2.2，并收集细胞用于后续实验。

1.2.5 细胞分组处理 取2.5 ml MPC5 细胞或转染si-SNHG14、si-NC、miR-16-5p mimics、miR-NC、si-SNHG14+anti-miR-16-5p、si-SNHG14 +anti-miR-NC的细胞（2.5×104个/ml）均接种至6 孔板中，培养12 h 后，分组处理。将MPC5 细胞分为对照组（NC组）和HG 组，其中NC 组细胞使用常规培养基培养；HG 组细胞用含30 mmol/L D-葡萄糖的培养基作用24 h。将 转染si-SNHG14、si-NC、miR-16-5p mimics、miR-NC、si-SNHG14+anti-miR-16-5p、si-SNHG14+anti-miR-NC 的细胞均用含30 mmol/L D-葡萄糖的培养基作用24 h，并分别记为HG+si-SNHG14 组、HG+si-NC 组、HG+miR-16-5p 组、HG+miR-NC 组、HG+si-SNHG14 +anti-miR-16-5p 组 和HG+si-SNHG14+anti-miR-NC 组。培养结束后，收集细胞，采用Western 印迹检测细胞中nephrin、podocin、synaptopodin、Bax、Bcl-2 和cleaved-caspase-3 蛋白表达，流式细胞术检测细胞凋亡。转染si-SNHG14、si-NC、pcDNA-SNHG14、pcDNA、miR-16-5p mimics、miR-NC 的MPC5 细胞分别记为si-SNHG14组、si-NC 组、pcDNA-SNHG14 组、pcDNA 组、miR-16-5p 组、miR-NC 组。

1.2.6 Western 印迹法检测蛋白表达 取各组处理后的细胞，加 RIPA 裂解液 裂解细 胞，4℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液，用BCA 法检测蛋白含量。然后行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），将分离蛋白转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，并置于5 %脱脂牛奶中封闭2 h。于4℃冰箱中分别用nephrin、podocin、synaptopodin、Bax、Bcl-2、酶切caspase-3 及GAPDH 一抗孵育过夜，洗膜后，用辣根过氧化酶标记的二抗37℃孵育1 h。加化学发光试剂，避光显影，凝胶成像系统曝光拍照，Image J 软件分析目的蛋白相对GAPDH 的表达量。

1.2.7 流式细胞仪检测细胞凋亡 取各组处理后的细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞2 次。参照Annexin V-FITC/PI 试剂盒操作说明，取1.0×106个细胞，加500 μl 结合缓冲液，重悬细胞。加10 μl Annexin V-FITC，室温避光孵育10 min。再加5 μl PI，室温避光孵育5 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.3 统计学方法 采用SPSS22.0 软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结果

2.1 HG 对小鼠肾脏足细胞MPC5 中SNHG14 和miR-16-5p 表达的影响 HG 组MPC5 细胞中SNHG14 水平显著高于NG 组（P＜0.05），miR-16-5p水平显著低于NG 组（P＜0.05）。见表1。

表1 HG 对MPC5 细胞中SNHG14 和miR-16-5p表达的影响(,n=9)

表1 HG 对MPC5 细胞中SNHG14 和miR-16-5p表达的影响(,n=9)

2.2 SNHG14 靶向调控miR-16-5p 的表达 生物信息学软件预测显示，SNHG14 的序列中含有与miR-16-5p 互补的核苷酸序列，见图1。miR-16-5p+WTSNHG14 组MPC5 细胞荧光素酶活性（0.41±0.04）显著低于共转染miR-NC 与WT-SNHG14 组（0.98±0.08，t=19.118，P=0.000），而miR-16-5p+MUTSNHG14 组MPC5 细胞荧光素酶活性（1.02±0.08）与miR-NC+MUT-SNHG14 组（1.03±0.09）差异无统计学意义（t=0.249，P=0.806）。pcDNA-SNHG14组MPC5 细胞中miR-16-5p 的表达量（0.38±0.04）显著低于pcDNA 组（1.00 ±0.08，P＜0.05），si-SNHG14 组MPC5 细胞中miR-16-5p 的表达量高于si-NC 组（0.99±0.09，P＜0.05）。

图1 SNHG14 的序列中含有与miR-16-5p 互补的核苷酸序列

2.3 抑制SNHG14 对HG 诱导的小鼠肾脏足细胞MPC5 中synaptopodin、nephrin 和podocin 蛋白表达的影响 si-SNHG14 组MPC5 细胞中SNHG14 水平（0.23±0.02）显著低于si-NC 组（1.02±0.09，t=25.706，P＜0.05），说明si-SNHG14 转染成功，MPC5细胞中SNHG14 的表达受到抑制。HG 组MPC5 细胞中synaptopodin、nephrin 和podocin 蛋白的表达量显著低于NG 组（P＜0.05）。HG+si-SNHG14 组MPC5 细胞中synaptopodin、nephrin 和podocin 蛋白的表达量显著高于HG+si-NC 组（P＜0.05）。见图2、表2。

图2 抑制SNHG14 对HG 诱导的MPC5 细胞中synaptopodin、nephrin 和podocin 蛋白表达的影响

表2 抑制SNHG14 表达对HG 诱导的MPC5 细胞中synaptopodin、nephrin 和podocin蛋白表达的影响(,n=9)

表2 抑制SNHG14 表达对HG 诱导的MPC5 细胞中synaptopodin、nephrin 和podocin蛋白表达的影响(,n=9)

与NG 组比较:1）P＜0.05；与HG+si-NC 组比较:2）P＜0.05；下表同

2.4 抑制SNHG14 对HG 诱导的小鼠肾脏足细胞MPC5 凋亡的影响 HG 组MPC5 细胞凋亡率和细胞中Bax、酶切caspase-3 蛋白的表达量均显著高于NG组（P＜0.05），而Bcl-2 蛋白的表达量显著低于NG 组（P＜0.05）。HG+si-SNHG14 组MPC5 细胞凋亡率和细胞中Bax、酶切caspase-3 蛋白的表达量均显著低于HG+si-NC 组（P＜0.05），而Bcl-2 蛋白的表达量显著高于HG+si-NC 组（P＜0.05）。见图3，图4，表3。

表3 抑制SNHG14 高糖诱导的MPC5 细胞凋亡的影响(,n=9)

表3 抑制SNHG14 高糖诱导的MPC5 细胞凋亡的影响(,n=9)

图3 抑制SNHG14 对HG 诱导的MPC5 细胞中凋亡相关蛋白表达的影响

图4 抑制SNHG14 HG 诱导的MPC5 细胞凋亡率的影响

2.5 过表达miR-16-5p 对HG 诱导的小鼠肾脏足细胞MPC5 损伤的影响 miR-16-5p 组MPC5 细胞中miR-16-5p 水平（2.28±0.12）显著高于miR-NC组（1.00±0.05，t=29.538，P＜0.05），说明miR-16-5p mimics 转染成功，MPC5 细胞中miR-16-5p 过表达。HG+miR-16-5p 组MPC5 细胞中synaptopodin、nephrin 和podocin 蛋白的表达量均显著高于HG+miR-NC 组（P＜0.05），MPC5 细胞凋亡率和Bax、酶切caspase-3 蛋白的表达量均显著低于HG+miR-NC组（P＜0.05），Bcl-2 蛋白的表达量显著高于于HG+miR-NC 组（P＜0.05）。见图5、表4。

图5 Western 印迹检测MPC5 细胞中凋亡相关蛋白及synaptopodin、nephrin 和podocin 蛋白表达的影响

表4 过表达miR-16-5p 对高糖诱导的MPC5 细胞损伤的影响(,n=9)

表4 过表达miR-16-5p 对高糖诱导的MPC5 细胞损伤的影响(,n=9)

2.6 干扰miR-16-5p 逆转抑制SNHG14 对HG诱导的小鼠肾脏足细胞MPC5 损伤的作用 HG+si-SNHG14+anti-miR-16-5p 组MPC5 细 胞中synaptopodin、nephrin 和podocin 蛋白的表达量均显著低于HG+si-SNHG14+anti-miR-NC 组（P＜0.05），MPC5 细胞凋亡率和Bax、cleaved-caspase-3 蛋白的表达量均显著高于HG+si-SNHG14+anti-miR-NC 组（P＜0.05），Bcl-2 蛋白的表达量显著低于HG+si-SNHG14+anti-miR-NC 组（P＜0.05）。见图6、表5。

图6 Western 印迹检测MPC5 细胞凋亡相关蛋白、synaptopodin、nephrin 和podocin 蛋白表达的作用

表5 干扰miR-16-5p 逆转抑制SNHG14 对HG 诱导的MPC5 细胞损伤的作用(,n=9)

表5 干扰miR-16-5p 逆转抑制SNHG14 对HG 诱导的MPC5 细胞损伤的作用(,n=9)

3 讨论

糖尿病肾病是导致糖尿病患者死亡的主要原因之一，其发病机制较为复杂，研究认为足细胞损伤在其发生发展中起重要作用〔11〕。HG 是造成足细胞损伤的重要原因之一，可直接损伤足细胞，并诱导足细胞凋亡。足细胞裂隙膜蛋白nephrin、podocin 和骨架蛋白synaptopodin 参与足细胞损伤〔12〕。本研究结果表明HG 环境下，基底膜蛋白受损，足细胞屏障破坏障碍。Bax/Bcl-2 参与调控细胞凋亡，Bax 表达升高可促进细胞凋亡，而Bcl-2 作用与Bax 相反，表达升高抑制细胞凋亡。Caspases 介导的级联反应在细胞凋亡中发挥关键调节作用，caspase-3 是caspases级联反应核心分子，被活化后执行细胞凋亡〔13，14〕。本研究结果说明HG 诱导促进了MPC5 细胞凋亡，与相关报道结果一致。

研究发现，SNHG14 参与脑卒中、肿瘤等疾病的发生和发展〔15〕。Cao 等〔16〕研究显示，抑制SNHG14表达可抑制脂多糖诱导的原代神经元凋亡和caspase-3 活性升高。本研究结果提示SNHG14 参与足细胞损伤过程；与SNHG14 表达未被抑制的MPC5 细胞相比，SNHG14 表达抑制的MPC5 细胞被HG 诱导后，细胞中nephrin、podocin 和synaptopodin蛋白表达水平显著升高，表明抑制SNHG14 表达可降低足细胞损伤，改善足细胞屏障破坏障碍；抑制SNHG14 表达可降低HG 诱导的MPC5 细胞凋亡。

研究显示，miR-16-5p 与糖尿病、胰岛素抵抗等密切相关，在糖尿病的发展过程中起重要作用〔17，18〕。张琳等〔19〕研究显示，糖尿病肾病患者血清中miR-16-5p 表达水平降低，且与患者病情严重程度密切相关。但目前，miR-16-5p 对肾脏足细胞损伤及凋亡的影响还未知。本研究结果说明miR-16-5p 对HG 诱导的MPC5 细胞损伤发挥保护作用；抑制SNHG14 表达通过上调miR-16-5p 表达进而保护HG 诱导的MPC5 细胞损伤及抑制其凋亡。