苯甲酸钠预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制

黄粮 吴瑞霞 吴刚 成忠 （武汉市第四医院心血管内科,湖北 武汉 430000）

动脉粥样硬化性疾病是导致死亡和残疾的重要原因。其中，心肌梗死有较高的发病率和死亡率，目前认为经皮冠状动脉介入治疗和溶栓治疗是最有效的治疗方法〔1，2〕。然而，心肌梗死后再灌注可能引起再次损伤，如何预防心肌缺血再灌注（I/R）损伤一直是医学研究的重点。苯甲酸钠（NaB）是肉桂的代谢产物。它通常用作调味材料和各种食品和化妆品的防腐剂〔3〕。NaB 很早就已应用于临床，Williams等〔4〕报道，NaB 能缓解D-丝氨酸诱导的肾毒性。在小鼠实验中，用NaB 能通过上调Treg 细胞缓解实验性脑脊髓炎〔5〕。NaB 还被用作治疗由肝代谢缺陷引起的高氨血症及儿童尿素循环缺陷〔6，7〕。而NaB 对于心肌缺血再灌注损伤的研究未见报道，本研究拟通过建立大鼠I/R 损伤模型，探索NaB 在I/R 损伤中的分子机制及与Akt/Nrf2 通路之间的内在联系。

1 材料与方法

1.1 实验动物 15 只8 周雄性SD 大鼠，由湖北中医药大学动物实验中心提供，质量200～250 g，进入实验前适应性环境2 w。

1.2 材料和试剂 NaB（Sigma 公司，美国），抗大鼠B 细胞淋巴瘤（Bcl）-2、Bcl-2 相关X 蛋白（Bax）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）-3、蛋白激酶B（Akt）、p-Akt、胞质核因子（NF）-E2 相关因子（Nrf）2、胞核Nrf2、血红素氧含酶（HO）-1 单克隆抗体，内参GAPDH 及二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒（Santa Cruz 公司，美国），ApopTag®荧光素原位细胞死亡检测试剂盒（万类生物科技有限公司，中国），自动生化分析仪（Beckman Coulter 公司，美国），流式细胞仪（Becton 公司，美国）。

1.3 方法

1.3.1 I/R 模型的建立 SD 大鼠使用10%水合氯醛（0.4 ml/100 g）腹腔注射麻醉，固定四肢后气管插管并连接动物呼吸机（潮气量为1.5 ml/100 g，频率60 次/min），安装心电监护仪，用针型电极记录大鼠心电图。手术刀片刮除大鼠胸前毛发，切开皮肤:以胸骨中线为基准，起于胸锁关节平线止于剑突上方。钝性分离肌群，剪断胸骨左缘处第2～4 根肋骨，开胸器撑开，将心包剪开暴露心脏。分离左冠状动脉前降支，用2/0 T 号线结扎左侧冠状动脉前降支。肉眼观察结扎部位缺血组织苍白或发绀，自心肌缺血在心电图中显示开始，30 min 后剪掉结扎线，使心肌血流恢复，随后保持120 min 再灌注。以心电图改变确定I/R 造模成功:冠状动脉左前降支结扎，ST 段明显抬高；再灌注时，ST 段抬高后回落。假手术组只打开胸腔，不进行结扎。

1.3.2 分组及给药 15 只大鼠随机分为3 组:假手术（Sham）组，I/R 组和I/R+NaB 组，I/R+NaB 组在造模前3 d 利用0.1 g/kg NaB 溶于生理盐水灌胃预处理，1 次/d，连续3 d。Sham 组，I/R 组予等量生理盐水灌胃预处理。24 h 后快速取出心肌组织及腹主动脉血。动脉血以3 000 r/min 离心10 min，取上清液存于试管并进入实验。

1.3.3 梗死面积和ST 段波幅 心肌组织取出后切除右心室和心房肌肉组织，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗后置于无菌台进行大体观察，将心肌组织按照冠状沟平行方向切片，厚度约3 mm，拍摄并分析。梗死面积（%）=梗死面积/总面积×100%。并取再灌注120 min 后Ⅱ导联ST 段波幅测量。

1.3.4 动脉血检测 采用全自动生化分析仪检测存于试管中的血清乳酸脱氢酶（LDH）、血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌钙蛋白（cTn）I 及cTnT 水平。

1.3.5 流式细胞仪检测心肌细胞凋亡水平 24 h后快速取下老鼠的心脏，用PBS 清洗并置于玻璃器皿中，利用均浆机将心肌组织粉碎，PBS 清洗并在1 000 r/min 4℃条件下离心5 min。收集沉淀并用PBS 清洗，在4℃条件下1 000 r/min 离心5 min。将颗粒重新悬浮在含有5 μl FITc-Annexin V 和10 μl PI 染色溶液的结合缓冲液中。将溶液在室温下在黑暗中静置15 min。利用300 目网过滤混合物，利用流式细胞仪分析细胞凋亡。

1.3.6 TUNEL 24 h 后快速取下老鼠的心脏，用PBS 清洗，放在玻璃器皿中，将心肌组织按照冠状沟平行方向切片，厚度约3 mm。按照ApopTag®荧光素原位细胞死亡检测试剂盒说明书操作，DAPI 使细胞核呈蓝色，凋亡细胞呈绿色。凋亡率（%）=绿色阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.3.7 Western 印迹检测凋亡蛋白及Akt/Nrf2 通路蛋白 24 h 后快速取下老鼠的心脏，充分研磨，3 ml/g蛋白裂解液充分裂解后，10 000 r/min 离心30 min。总蛋白浓度通过二喹啉甲酸（BCA）法测定。并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转膜，封闭，caspase-3、Bax、Bcl-2、Akt、p-Akt、胞质Nrf2、胞核Nrf2、HO-1 单克隆抗体孵育过夜，二抗1 ∶5 000 孵育3 h，加入显色剂显色，内参GAPDH。凝胶成像系统成像，Image J 软件计算灰度值。

1.3.8 p-Akt 及HO-1 免疫组织化学染色 24 h 后快速取下老鼠的心脏，用PBS 清洗，放在玻璃器皿中，将心肌组织按照冠状沟平行方向切片，厚度约3 mm。并进行进行p-Akt 及HO-1 免疫组织化学染色，利用ImagePro Plus 半定量分析其光密度值（OD）。

1.4 统计学分析 采用SPSS18.0 软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结果

2.1 梗死面积及ST 段波幅 I/R 组梗死面积显著高于Sham 组，I/R+NaB 组梗死面积显著低于I/R组（P＜0.05）；I/R 组ST 段波幅显著高于Sham 组，I/R+NaB 组ST 段波幅显著低于I/R 组（P＜0.05）。见图1、图2、表1。

图1 各组心肌组织大体观察

图2 各组心电图Ⅱ导联

表1 各组梗死面积及ST 段波幅比较(,n=5)

表1 各组梗死面积及ST 段波幅比较(,n=5)

与Sham 组比较:1）P＜0.05；与I/R 组比较:2）P＜0.05；下表同

2.2 血清LDH、CK-MB、cTnI 及cTnT 水平 I/R 组大鼠血清LDH、CK-MB、cTnI 及cTnT 水平显著高于Sham 组（P＜0.05），I/R+NaB 组大鼠血清LDH、CKMB、cTnI 及cTnT 水平显著低于I/R 组（P＜0.05）。见表2。

表2 各组血清LDH、CK-MB、cTnI 及cTnT 水平比较(,n=5)

表2 各组血清LDH、CK-MB、cTnI 及cTnT 水平比较(,n=5)

2.3 心肌细胞凋亡变化 I/R 组心肌细胞凋亡率〔（31.86±2.61）%〕 显著高于Sham 组〔（6.48 ±0.53）%，P＜0.05〕，I/R+NaB 组心肌细胞凋亡率〔（19.63±1.54）%〕显著低于I/R 组（P＜0.05）。见图3。

图3 流式细胞仪检测各组心肌细胞凋亡

2.4 TUNEL 染色 Sham 组、I/R 组和I/R+NaB 组绿染的阳性细胞率分别为（13.6±3.5）%、（42.8±8.1）%和（35.7±6.4）%，I/R 组阳性细胞率显著高于Sham 组和I/R+NaB 组（均P＜0.05）。见图4。

图4 各组心肌组织细胞凋亡(TUNEL,×400)

2.5 凋亡蛋白表达 I/R 组caspase-3 和Bax 蛋白显著高于Sham 组，Bcl-2 蛋白显著低于I/R 组（均P＜0.05），I/R+NaB 组caspase-3 和Bax 蛋白显著低于I/R 组，Bcl-2 蛋白显著高于I/R 组（均P＜0.05）。见图5，表3。

表3 各组凋亡相关蛋白表达水平比较(,n=5)

表3 各组凋亡相关蛋白表达水平比较(,n=5)

图5 Western 印迹检测凋亡蛋白表达

2.6 Akt/Nrf2 通路蛋白表达 Sham 组、I/R 组及I/R+NaB 组之间Akt、胞质Nrf2 蛋白表达无显著差异（P＞0.05）；p-Akt、胞核Nrf2 及HO-1 蛋白表达I/R+NaB 组＞I/R组＞sham 组（均P＜0.05）。见图6、表4。

图6 Western 印迹检测Akt/Nrf2 通路蛋白表达

表4 各组Akt/Nrf2 通路蛋白表达水平比较(,n=5)

表4 各组Akt/Nrf2 通路蛋白表达水平比较(,n=5)

2.7 p-Akt 及HO-1 免疫组织化学染色 I/R 组可见棕染的p-Akt、HO-1 蛋白，而I/R+NaB 组可见明显p-Akt、HO-1 蛋白表达；ImagePro Plus 半定量分析显示，Sham 组、I/R 组和I/R+NaB 组绿染的阳性细胞率分别为（7.8±3.9）%、（12.7±5.6）%和（23.9±7.1）%，I/R+NaB 组＞I/R 组＞Sham 组（均P＜0.05）。见图7。

图7 p-Akt 及HO-1 免疫组织化学染色(DAB,×100)

3 讨论

I/R 损伤是全世界心源性死亡的主要原因之一。心肌梗死后尽管早期溶栓药物治疗可减少心肌梗死面积，但这种治疗往往会诱发I/R 损伤。目前已有多种药物被报道对I/R 损伤有效，但尚没有一种有效药物预防临床I/R 损伤〔8〕。NaB 作为一种芳香羧酸的钠盐，已被报道有抗凋亡作用，NaB 在非细胞毒性浓度下抑制小胶质细胞中的NF-κB 活性，并降低小鼠肝组织中的NF-κB 基因表达〔9，10〕。梗死面积被认为是评估心肌梗死损伤严重程度的金标准，并且本研究发现NaB 可显著抑制I/R 后心电图ST 段波幅。表明，NaB 能抑制心肌损伤所致的生物膜系统损伤，减少收缩蛋白LDH、cTnI 及cTnT 及肌细胞特有酶CK-MB 从损伤的心肌内部进入到血液，客观证实了NaB 能有效改善心肌损伤情况。

细胞凋亡在I/R 损伤等多种病理进程中对心肌细胞的丢失起着重要作用。已经证明，当I/R 损伤发生时，心肌细胞释放促凋亡因子，线粒体凋亡途径可能被激活〔11，12〕。Bax 是一种促凋亡蛋白，而Bcl-2是一种抗凋亡蛋白。当心肌缺血后，Bcl-2 与Bax 在心肌细胞都有表达，前者的过度表达能显著抑制I/R后心肌细胞的凋亡，减少梗死面积，后者则促进心肌细胞凋亡，增加梗死面积〔13〕。本研究发现I/R 后心肌细胞大量凋亡，而NaB 能显著抑制线粒体凋亡蛋白caspase-3、Bax 表达，提高Bcl-2 表达，提示NaB能通过抗凋亡效应保护I/R 损伤。

已有大量文献证实Akt 通路在I/R 损伤过程中的重要保护作用〔14，15〕。Akt 磷酸化形成的p-Akt 可抑制Bax、caspase 等促凋亡蛋白形成，促进Bcl-2 生成，同时促进糖原合成酶激酶（GSK）-3β 磷酸化从而抑制细胞凋亡〔16〕。Nrf2 是细胞HO-1 表达的关键调节因子，Nrf2 能与Kelch 样相关蛋白-1（Keap1）结合形成Keap1-Nrf2 复合物，并在正常生理条件下限制Nrf2 在细胞质中的表达〔17〕。Nrf2 在氧化应激或其他潜在损伤条件下从Keap1 释放，并转移到细胞核，在胞核中结合抗氧化反应元件序列，介导HO-1等抗凋亡基因的转录激活〔18〕。Akt/Nrf2 通路已被证实与HO-1 表达有关〔19〕。HO-1 是一种诱导酶，由于其能够将血红素降解为胆绿素或胆红素、一氧化碳和游离铁，因此具有很强的抗氧化活性〔20〕。此外，已经证明HO-1 作为植物源性化学物质，可通过抑制氧化损伤发挥心脏保护作用〔21，22〕。本研究提示NaB 能通过促进Akt 磷酸化、促进Nrf2 胞核易位，提高HO-1 蛋白表达抑制心肌细胞凋亡，从而发挥保护作用。

综上，NaB 预处理通过上调Akt/Nrf2 信号轴，抑制I/R 损伤导致的心肌细胞凋亡，在一定程度上缓解了I/R 损伤进程，为预防I/R 损伤提供了新的思路。