蒙药德都红花-7 味散对CCl4 所致肝纤维化大鼠Bcl-2、Bcl-x 蛋白表达的影响

薛兰 牧仁 徐艳华 陈红梅 娜日苏 巴图德力根 韩志强

（1 内蒙古民族大学附属医院,内蒙古 通辽 028007;2 内蒙古民族大学）

肝纤维化（HF）在人群中的发病相当普遍。乙型肝炎和丙型肝炎是引起肝纤维化和肝硬化的最常见疾病。蒙药德都红花-7 味散组方由红花、天竺黄、蓝盆花、木通、地丁、诃子、麻黄等7 味蒙药组成，具有清肝热功能，主治新旧肝病，肝损伤，肝血热、眼睛发黄〔1〕。前期研究表明德都红花-7 味散有对四氯化碳（CCl4）所致肝损伤具有明显的降酶、保肝、抗纤维化，促进HSC 细胞凋亡，抑制肝星状细胞（HSC）细胞增殖的作用〔2，3〕。本研究探讨蒙药德都红花-7 味散对CCl4所致肝纤维化大鼠Bcl-2、Bcl-x蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及用药 SD 大鼠，雄性，SPF 级，体重180～220 g，许可证号:SCXKC（吉）-2018-0007，购自长春亿斯实验动物技术有限责任公司。水飞蓟宾胶囊，国药准字H2040299，天津天士力圣特制药有限公司，批号:950 605007；德都红花-7 味散，批准文号:内卫制字M13060134，购自内蒙古民族大学附属医院，批号20191224。

1.2 主要试剂及仪器 橄榄油（分析纯），国药集团化学试剂有限公司，批号20 190129；CCl4（分析纯），天津市风船化学试剂科技有限公司，批号20191010。Bcl-2、Affinity、批号6139；Bcl-x、CST、批号2764。激光共聚焦显微镜，Nikon（Japan），Eclipse Ti-E；全景切片扫描仪，PM2235 莱卡组织切片机、EG1150H 莱卡包埋机，莱卡公司；图片分析软件Media Cybemetics（U.S.A），Image-Pro Plus6.0。

1.3 动物造模、分组、给药 将34 只SD 雄性大鼠适应实验室1 w 后，按体重分层随机分为空白组、模型组、水飞蓟素组、德都红花-7 味散组，每组10 只。除空白对照组，其他组腹腔注射CCl4橄榄油溶液2.0 ml/kg，造模1～2 w 腹腔注射10%的CCl4橄榄油溶液每周2 次，3～4 w 腹腔注射15%的CCl4橄榄油溶液每周2 次，5 w 腹腔注射20%的CCl4橄榄油溶液2 次，6、7 w 腹腔注射15%的CCl4橄榄油溶液每周1 次。空白对照组和模型组灌胃蒸馏水，德都红花-7 味散低剂量组按0.3 g/kg，水飞蓟宾组21 mg/kg灌胃给药，给药7 w 后动物禁食12 h，取肝组织%多聚甲醛固定〔4〕。

1.4 肝组织组织病理学检查 肝组织切片用4%多聚甲醛固定，组织脱水，透明，用石蜡包埋，切片，HE 染色，光学显微镜下观察分析，肝损伤程度疗效评价〔5，6〕。

1.5 免疫组织化学方法检测大鼠肝组织中Bcl-2、Bcl-x 蛋白表达 取肝组织常规固定、脱水、透明、石蜡包埋，切片，抗原修复液，过氧化酶阻断溶液阻断内源性过氧化物酶的活性，第一抗抗体、第二抗体、链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，二氨基联苯胺（DAB）溶液，苏木素复染，观察结果。判读抗体的胞质、胞膜染色的染色强度（0/1+/2+/3+）和染色阳性率，评分。

1.6 统计方法 采用SPSS20.0 软件进行t及χ2检验。

2 结果

2.1 各组大鼠肝组织病理改变 HE 染色结果表明空白组肝脏组织被膜由厚薄均匀的富含弹性纤维致密结缔组织构成，肝小叶分界明显，排列规则，肝小叶中央为中央静脉，周围是大致呈放射状排列的肝细胞和肝血窦，肝细胞排列规则、整齐，肝窦无明显扩张或挤压；相邻肝小叶之间的门管区无明显异常；未见明显的炎性改变。模型组中央静脉、汇管区周围及肝实质内均可见大量的肝细胞脂肪变性，肝细胞内可见体积较小、数量不等的圆形空泡；中等量的汇管区周围可见少量的炎性细胞浸润；小叶结构紊乱，多见纤维间隔形成；未见明显的细胞坏死。水飞蓟宾组、德都红花-7 味散组中央静脉、汇管区周围及肝实质内肝细胞颗粒变性明显轻于模型组；小叶结构紊乱，多见纤维间隔形成与模型组比较较轻。见表1，图1。

图1 各组肝组织(HE 染色,×100)

表1 德都红花-7 味散对慢性肝损伤大鼠肝炎症活动度和纤维化分期的影响(n)

2.2 德都红花-7 味散对大鼠肝组织Bcl-2、Bcl-x 蛋白表达的影响 与空白组比较，模型组Bcl-2、Bcl-x蛋白表达升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，水飞蓟宾组、德都红花-7 味散组Bcl-x、Bcl-2 蛋白表达下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2，图2。

表2 德都红花-7 味散对大鼠肝组织Bcl2、Bcl-x 蛋白表达的影响(,n=10)

表2 德都红花-7 味散对大鼠肝组织Bcl2、Bcl-x 蛋白表达的影响(,n=10)

与空白组比较:1）P＜0.05；与模型组比较:2）P＜0.05

图2 德都红花-7 味散对各组肝组织Bcl-2、Bcl-x 蛋白表达的影响(DAB,×800)

3 讨论

HF 继发于各种原因，如酒精、肝炎病毒、代谢性疾病、自身免疫相关性疾病等引起的肝脏损伤组织修复过程中的代偿反应，以细胞外基质（ECM）的合成与降解失衡、并在肝细胞间隙可逆性沉积为特征〔6〕。HSC 在HF 病理进程中发挥了重要作用。各种原因致使肝损伤后，造成肝星状细胞激活，转化为肌成纤维细胞，合成ECM 分泌增加，降解减少，以致大量的ECM 在肝内沉积，形成HF〔7〕。Bcl-2 蛋白家族是调控线粒体凋亡途径的关键因子。抗凋亡的多结构域蛋白，主要是Bcl-2、Bcl-x。HSC 凋亡过程中Bax 的表达减少而Bcl-2 和Bcl-x 蛋白的表达增加〔8〕。本研究表明德都红花-7 味散能够明显减轻CCl4所致大鼠的HF，降低肝组织Bcl-2、Bcl-x 蛋白表达。蒙药德都红花-7 味散能够明显减轻肝纤维化，其机制与调节抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x 表达相关。