类风湿关节炎患者血清细胞因子检测与CD100 的相关性

周进 袁锟 刘巍 范建波 王雯雯 虞子良 周小钢 徐大伟

（南通大学第二附属医院 南京医科大学康达学院南通临床医学院 1 骨科,江苏 南通 226001;2 风湿免疫科）

类风湿关节炎（RA）是自身免疫类疾病，发病率为0.32%～0.36%，发病率及致残率均较高〔1，2〕。中国目前有（400～500）万人患有类风湿疾病，主要发病有关节表现和关节外表现，关节表现以手关节为主，近端指间关节、掌指关节、腕关节有关节疼痛、肿胀，关节功能受限，关节变形及末端关节严重骨质疏松〔3〕；关节外表现包括眼部结膜炎、干眼症及肺间质病变，肾脏压迫，心脏压迫及消化道压迫，外周神经压迫等关节肌肉表现，所以是全身性、多器官、多系统病变，致残率较高，病程反复，但最终会造成小关节变形，提前干预对于治疗RA 至关重要〔4〕。

RA 的发病机制与免疫细胞有关（T 淋巴细胞、B 淋巴细胞、单核细胞等），这类细胞在血液循环过程中，聚集到关节内从而激发炎症。在RA 形成过程中起重要作用是异常增殖的炎症细胞和炎症介质相互作用。研究表明，RA 患者初期关节囊滑膜成纤维细胞层下血管网已出现血管增生现象〔5〕。这种血管的异常增生为RA 病程的发展提供至关重要的微环境基础。新生血管网密度增加，形成血管翳〔6〕。密集的血管网为各种类型的免疫细胞到达关节腔提供了物理空间上的道路，关节囊内细胞表面表达的自身抗原又为吸引各种免疫细胞提供了化学成分上的引诱。从理论上讲，治疗RA 的关键在于两个通路，一是提前干预，阻止血管翳的形成；二是中和抗体，阻断免疫细胞趋化而来〔7〕。

分化抗原簇100（CD）100 在免疫细胞活化及免疫应答方面发挥了重要作用，被称为轴突导向因子（Sema）4D，有两种存在形式，一种以Ⅰ型跨膜蛋白存在于细胞膜表面，被称为膜结合型CD100（mCD100），另一种是可溶型CD100（sCD100）游离于血清中〔8，9〕。CD100 结合CD72 可能会对B 淋巴细胞起到负调控作用，参与RA 的发病，抑制T 细胞来源的CD100 的功能或将成为非常有前景的治疗RA 的方法。本文拟分析RA 患者血清细胞因子检测与CD100 的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2019 年9 月1 日至2020 年6 月1日南通大学第二附属医院收治58 例RA 患者，包括活动期RA 患者26 例，稳定期RA 患者32 例，年龄60～72 岁，平均62.7 岁，男30 例，女28 例。体检中心行常规体检26 例为对照组，其中男12 例，女14 例，年龄61～70 岁，平均63.2 岁。符合《2018 中国类风湿关节炎诊疗指南》中活动期RA 诊断标准:晨僵（≥45 min）、滑膜炎凭证、典型放射学RA 骨破坏变化，出现1 个及以上关节肿痛，且排除其他疾病所致关节炎，红细胞沉降率（ESR）≥40 mm/h、C 反应蛋白（CRP）＞15 mg/L。若部分标准欠缺，评分可用美国风湿学会（ACR）/欧洲抗风湿病联盟（EULAR）2009 系统，总分≥6 分确诊RA；RA 患者病情活动度的评估:DAS28=〔0.56×sqrt（T28）+0.28×sqrt（SW28）+0.7×Ln（ESR）〕×1.08+0.16，数值范围为0～10。所有病例无尿蛋白、周围神经病变、生物制剂应用史、药物过敏史、肺间质纤维化等其他影响因素，所有人群精神认知正常，试验前签署知情同意。

1.2 主要试剂 淋巴细胞分离液（北京索莱宝公司）；R&D 公司重组人CD100；美天旎CD8+T 细胞分选试剂盒；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）、白细胞介素（IL）-6、IL-17 试剂盒（美国RB 公司）；武汉华美公司CD100、干扰素（IFN）-γ 和肿瘤坏死因子（TNF）-α 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒；美国BD 公司的抗CD3-APC、抗CD8-APC Cy7、抗CD100-PE 试剂盒；抗CD3/CD28（美国eBioscience 公司）；Abcam 穿孔素、颗粒酶B 酶联吸附斑点试验（ELISPOT）检测试剂盒。

1.3 主要仪器 M680 型全自动酶标仪（美国Bio-Rad 公司）、SORVALL 高速低温离心机（美国Kendor 公司）；FACS-Calibur 流式细胞仪（美国BD 公司）；ELISPOT 读板仪（德国AID 公司）；磁力分离架（德国美天旎公司）。

1.4 血清的收集与保存 采集RA 患者和对照组静脉血15 ml，保存于促凝管。2 h 内，4 000 r/min离心10 min，收集上层血清，置于1.5 ml 离心管中，编号。-80℃冰箱备检、保藏。

1.5 外周血单个核细胞分离 外周血单个核细胞（PBMC）分离:选取淋巴细胞分离液、密度梯度离心法分离PBMCs。取5 ml 样品，等体积无菌磷酸盐缓冲液（PBS）稀释混匀、取5 ml 淋巴细胞上清分离液。20℃，3 000 r/min 离心25 min。吸取白膜层，收集PBMC。

CD8+T 细胞分选:用试剂盒进行分选，取1×107个PBMCs，3 000 r/min 离心15 min 弃上清，重悬细胞（40 μl 缓冲液），加生物素（10 μl）标记的抗体，混匀、4℃孵化5 min，加入缓冲液（30 μl），加20 μl CD8+T 细胞微球抗体（包含抗CD14、抗CD61、抗生物素），混匀，4℃孵育10 min。通过分离柱的未标记细胞，为富集的CD8+T 细胞。

1.6 构建直接接触培养、间接接触培养系统 按照王新伟等〔10〕的方法建立，HLA-A2 限制性RA 患者的CD8+T 细胞和HepG 细胞直接接触和间接接触培养系统。

1.7 细胞因子检测 取GM-CSF、IL-6、IL-17 和TNF-α 试剂盒，严格按照说明书操作。采用ELISA，应用Bio-RAD 酶标仪测量450 nm 处吸光度值，并换算成浓度值。

1.8 CD100 和细胞因子表达检测 血浆/培养上清细胞因子:酶标抗体工作液进行稀释，洗涤液稀释。标注标准品曲线，设立空白对照、选择阴性对照，将100 μl 标准品和待测样本加入反应孔中，封口。37℃，90 min 孵 育，吸 样，加入洗 涤缓冲 液（250 μl/孔），吸出前浸泡1 min，吸干，洗涤5 次。加入生物素标记的二抗（100 μl/孔），封死，37℃孵育60 min，洗板5 次，加ABC 工作液（100 μl/孔），封孔，37℃孵育30 min，洗板5 次，加入TMB 显色工作液（100 μl/孔），37℃避光反应，出现蓝色梯度（标准品3～4 孔）、且有后3～4 孔差别不明显，加入终止液100 μl TMB 每孔，30 min 显色反应。计算酶标仪测定OD 450 nm 波长处吸光度细胞因子浓度。

1.9 CD8+T 细胞MFI 检测 采用流式细胞仪，将PBMCs 转入FACS 管中，1 000 r/min 离心5 min。PBS 洗涤2 次，加入滴加流式抗体稀释液80 μl（抗CD3-APC、抗CD8-APCCy7、抗CD100-PE），加1 μl流式抗体，重悬，4℃避光孵育30 min，PBS 洗涤2次，2%多聚甲醛溶液固定，上机检测分析结果。

1.10 颗粒酶B、CD8+T 细胞分泌穿孔素水平检测 取PBS（100 μl/孔）至聚偏氟乙烯（PVDF）平板，室温孵育10 min，吸净液体，加入CD8+T 细胞（5×104个/孔），加抗CD3/CD28（终浓度1 μg/ml），设立阴性对照（无刺激源），37℃、5% CO2培养20 h，吸净液体，加0.1%吐温20 的PBS（100 μl/孔），4℃孵育10 min，并洗涤3 次。采用1% BSA 的PBS（10 ml）稀释检测抗体，稀释检测抗体，加入孔中（100 μl/孔），25℃孵育1.5 h，PBS 洗涤3 次，含0.1%吐温20。稀释的链霉亲和素碱性磷酸酶（100 μl/孔），倍数为1 ∶5 000。室温孵育1 h，洗涤3 次，吸净残留液，加入BCIP/NBT 显色底物，5～15 min（100 μl/孔）后，显色细胞数计数，采用ELISPOT 读板仪。SFC=样本SFC-阴性对照SFC，分析斑点形成数SFC。CD8+T 细胞受HLA-A02 限制，用sCD100 刺激24 h。清洗CD8+T 细胞两次，直接接触方式与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）共培养，或间接接触的方式。48 h 培养，收获上清液。直接接触共培养:HUVECs 的死亡是通过CD8+T 细胞分泌细胞因子来介导的穿孔素和颗粒酶途径。以间接接触共培养的方式，HUVECs 的死亡仅由CD8+T 细胞分泌细胞因子，不需要细胞直接接触〔9〕。

1.11 统计学处理 采用SPSS21.0、Origin9.0 软件进行单因素方差分析、SNK-q检验、配对t检验及Wilcoxon 配对检验。

2 结果

2.1 CRP、ESR 水平、DAS28 检测 活动期RA 组CRP、ESR、DAS28 水平显著高于稳定期RA 组、对照组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组年龄、CRP、ESR 和DAS28 比较〔〕

表1 各组年龄、CRP、ESR 和DAS28 比较〔〕

与活动期RA 组比较:1）P＜0.05

2.2 各组细胞因子水平检测 与稳定期RA 组和对照组相比，活动期RA 组血清GM-CSF、IL-6、TNF-α水平均较高（P＜0.01 ）；稳定期RA 组血清中GM-CSF、IL-6 和TNF-α 水平显著高于对照组（P＜0.05），3 组IL-17 水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组血清GM-CSF、IL-6、IL-17 和TNF-α 水平比较(,pg/ml)

表2 各组血清GM-CSF、IL-6、IL-17 和TNF-α 水平比较(,pg/ml)

与对照组比较:1）P＜0.05，2）P＜0.01；与稳定期RA 组比较:3）P＜0.01

2.3 RA 患者血浆sCD100、IgA 水平检测 对照组血浆sCD100 水平为（5.73±1.36）ng/ml，活动期RA组为（7.05±1.77）ng/ml，较RA 组显著升高（P=0.002 6），稳定期RA 组为（6.01±0.95）ng/ml，较对照组显著升高（P=0.047）。对照组血清IgA 水平〔（2.19±0.83）g/L〕低于活动期RA 组〔（3.40±1.50）g/L〕、稳定期RA 组〔（2.68±1.14）g/L〕，差异有统计学意义（P=0.033、0.041）。血清sCD100 水平与IgA 水平呈正相关（R2=0.542 2，P＜0.001），见图1。

图1 RA 患者sCD100 水平与IgA 水平的相关性

2.4 外周血CD8+T 细胞CD100 的MFI 值检测 与对照组相比，活动期RA 组外周血CD100+CD4+T淋巴细胞表面100 的MFI 值明显降低（P＜0.05），稳定期RA 组MFI 值明显高于活动期RA 组（P＜0.05）。3 组外周血CD100+CD15+粒细胞、CD100+CD8+T 淋巴细胞、CD100+CD19+B 淋巴细胞、CD100+CD14+单核细胞表面CD100 的MFI 值差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 外周血各细胞亚群胞膜表面CD100 的MFI 值()

表3 外周血各细胞亚群胞膜表面CD100 的MFI 值()

与对照组比较:1）P＜0.05；与稳定期RA 组比较:2）P＜0.05

2.5 sCD100 刺激RA 患者CD8+T 细胞水平检测 重组人sCD100 刺激24 h，从健康对照组和RA 患者中纯化CD8+T 细胞。RA 患者T 细胞与对照组比较，CD100 刺激后CD8+T 细胞上清液中IFN-γ 和TNF-α 水平显著升高（P＜0.01）。此外，CD8+T 细胞与对照组穿孔素和颗粒酶B 的水平相比，sCD100 刺激后产生增加（P＜0.01）。见表4。RA 患者与对照组相比，sCD100 刺激的CD8+T 细胞诱导靶细胞HUVECs 死亡率显著高于无sCD100 刺激的对照组（P＜0.05）。在间接接触共培养的方式下，sCD100刺激RA 组与对照组时，细胞因子诱导的HUVECs死亡无显著差异（P＞0.05）。与直接接触和间接接触共培养方式的对照组相比，RA 组培养的上清液中IFN-γ 和TNF-α 水平显著升高（P＜0.05）。CD8+T 细胞在RA 组和间接接触共培养的对照组的刺激中，分泌IFN-γ 和TNF-α 也显著增加（P＜0.05），见表5～7。

表4 重组人CD100 刺激CD8+T 细胞、TNF-α、INF-γ、穿孔素检测及颗粒酶B 检测()

表4 重组人CD100 刺激CD8+T 细胞、TNF-α、INF-γ、穿孔素检测及颗粒酶B 检测()

表5 不同培养方式靶细胞死亡率检测(,%)

表5 不同培养方式靶细胞死亡率检测(,%)

表6 不同培养方式IFN-γ 检测(,pg/ml)

表6 不同培养方式IFN-γ 检测(,pg/ml)

表7 不同培养方式TNF-α 检测(,pg/ml)

表7 不同培养方式TNF-α 检测(,pg/ml)

3 讨论

本研究结果表明，细胞因子诱导RA 患者发生关节滑膜炎，RA 的活动度可借助GM-CSF、IL-6 及TNF-α 的水平进行判断；GM-CSF 参与细胞因子网络调控，与血清IL-6 和TNF-α 的水平呈正相关。

CD100 以轴突诱导因子方式，定向诱导轴突生长锥的生长。CD100 广泛表达于静息状态下的B细胞、激活的T 细胞和自然杀伤细胞等。CD100 有固定在细胞表面的膜蛋白和可溶性CD100，只存在于病理状态下，如炎症和肿瘤。

RA 患者外周sCD100 上调，调节下调CD8+T 细胞上的mCD100，导致CD8+T 细胞的细胞毒性升高。重要的是，sCD100 刺激促进了CD8+T 细胞的细胞溶解活性使靶细胞的直接细胞毒性升高。CD100 发挥重要的 生物学活性，是免疫 调控分 子〔12〕。mCD100 脱落，逐渐形成细胞亚群CD8-CD100-T 细胞，用于控制病毒感染〔13〕。感染后的免疫应答可以检测到CD100 的作用，增强B 细胞、自然杀伤细胞及CD8+T 细胞功能，加快病毒清除〔14，15〕。

RA 患者体内存在多种免疫分子表达。血清sCD100 表达水平在RA 患者中降低，水平升高是T细胞表面mCD100。机体免疫个体的差异，导致表达模式变化，降低的CD8+T 细胞表面mCD100 水平可能与mCD100 脱落有关〔16～18〕；稳定期RA 患者血浆sCD100 水平下降，CD8+T 细胞表面mCD100 水平升高。

由于CD8+T 细胞存在CD100 的受体CD72，RA患者的CD8+T 细胞分泌细胞因子增加，但杀伤靶细胞不足，可发挥细胞毒性作用。CD8+T 细胞功能难以保持，是受sCD100 表达减少影响，发生功能障碍。单核细胞、T 细胞、B 细胞、自然杀伤细胞等的表面表达mCD100。mCD100 脱落，sCD100 表达。CD100 在其他免疫细胞中的调控作用有待进一步研究。RA 的症状是由两条通路，两条通路的交汇点CD100 具有重要病理学价值，所以将CD100 作为治疗的分子靶标，有很大可能减弱RA 的症状。

总之，改变mCD100 和sCD100 表达模式变化，以CD100 作为治疗靶点，极有可能会大大减轻RA的症状，副作用也会较小，为未来治疗RA 提供了有力的理论和实践支撑。