NOD 样受体在口腔鳞状细胞癌中的表达及意义

王桥 宋波 冯博 季佳 李佐强

（齐齐哈尔医学院 1 附属第二医院口腔科,黑龙江 齐齐哈尔 161006;2 临床病原教研室;3 齐齐哈尔五官医院口腔科;4 齐齐哈尔医学院附属第三医院教研科）

口腔颌面部恶性肿瘤约占人体恶性肿瘤的3%，其中90%以上为鳞状细胞癌，其局部复发性高，预后差，晚期生存率低，导致患者即使存活下来也由于手术造成的面部缺损，而严重影响患者的心理和生活质量〔1～3〕。口腔鳞状细胞癌（OSCC）目前发病机制不甚明了，但研究显示基因的突变及信号通路的失控在OSCC 的发生发展过程发挥着重要作用〔2，4，5〕。核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）即NOD 样受体，是一种位于细胞质内的模式识别受体，能够非特异性的识别各种致病微生物，在微生物感染中具有重要作用，在肿瘤中的研究较少〔6，7〕。本文将检测NOD 样受体在OSCC 中的表达，从而探讨NOD 样受体在OSCC 发生发展过程中的临床意义。

1 材料与方法

1.1 标本来源 2016 年10 月至2019 年10 月齐齐哈尔医学院附属第二医院做过手术切除的82 例石蜡标本，患者经病理检查证实为OSCC，术前均未接受放、化疗。患者年龄28～76 岁，中位年龄51.5岁。男46 例，女36 例。＜50 岁30 例，≥50 岁52例。低分化48 例，中分化19 例，高分化15 例。根据国际TNM 国际分期:Ⅰ期18 例、Ⅱ期19 例、Ⅲ期24 例、Ⅳ期21 例。另外选取82 例距离癌组织＞5 cm的癌旁舌正常黏膜组织作为对照。

1.2 主要试剂及仪器 兔抗人NOD1 及NOD2 多克隆抗体均购于北京中杉金桥生物技术有限公司；二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒购于武汉博士德生物技术有限公司。BH-2 显微镜购于日本OLYMPUS 公司。

1.3 免疫组化法检测NOD1 及NOD2 表达 石蜡标本60℃烤片30 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡，100%、95%、85%、75% 酒精脱水，3% H2O2室温灭活30 min，柠檬酸盐溶液煮沸2 min 进行抗原修复，滴加一抗（兔抗人NOD1 及NOD2 多克隆抗体）4℃过夜孵育、二抗室温孵育，DAB 显色，苏木素复染并封片，最后在光镜下观察蛋白的染色情况。选取磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照。

1.4 结果判断 NOD1 及NOD2 蛋白主要定位于细胞质中，当出现棕黄色或棕褐色颗粒，说明为阳性表达。两名病理科医生进行阅片。根据细胞染色强度判定:无染色为0 分，浅黄色为1 分，棕黄色为2分，棕褐色为3 分。根据阳性细胞比率判定:未着色为0 分，1%～25% 为1 分，26%～50% 为2 分，51%～75%为3 分，＞75%为4 分。最后根据染色强度评分与阳性细胞比率评分的乘积作为最终的染色评分:阴性（-，0～2 分），弱阳性（+，3～4 分），中等阳性（荻，5～8 分），强阳性表达（莘，9～12分）。≥3 分说明细胞阳性表达。

1.5 数据分析 采用SPSS17.0 软件进行χ2检验，Pearson 相关分析。

2 结果

2.1 OSCC 组织及癌旁舌正常黏膜组织中NOD1 及NOD2 的表达 OSCC 组织中NOD1、NOD2 的阳性表达明显低于癌旁舌正常黏膜组织（均P＜0.001），见表1。

表1 NOD1 及NOD2 在OSCC 组织及癌旁舌正常膜组织中的表达〔n(%),n=82〕

2.2 NOD1 及NOD2 表达与OSCC 患者临床病理参数的关系 Ⅲ～Ⅳ期NOD1 及NOD2 阳性表达率显著低于Ⅰ～Ⅱ期（P＜0.01，P＜0.001），有淋巴结转移NOD1 及NOD2 阳性表达率显著低于无淋巴结转移（P＜0.001），低分化中NOD1 及NOD2 阳性表达率显著低于中高分化（均P＜0.001）。而OSCC 组织中NOD1 及NOD2 阳性表达率与年龄、性别无关。见表2。

表2 NOD1 及NOD2 阳性表达与OSCC 患者临床病理参数的关系〔n(%)〕

2.3 OSCC 组织NOD1 及NOD2 表达的相关性 OSCC1 组织中，NOD1 与NOD2 表达正相关（r=0.556，P＜0.01）。

3 讨论

NOD 样受体有5 个亚家族，分别为NLR（A、B、C、P 和X），其中NLRC 及NLRP 是其主要类型，NOD1、NOD2 是NLRC 亚家族研究最多的2 个成员。NOD1、NOD2 均由3 个结构域组成，分别为位于羧基末端LRR 结构域，位于分子中间NBD 结构域及位于氨基末端EBD 结构域，这些结构域通过识别配体、寡聚化及介导蛋白质之间相互作用，将信号传递给下游通路。另外NOD1 及NOD2 均含有半胱氨酸募集结构域。NOD 样受体自发现以来，均作为先天性免疫应答的一部分参与细菌入侵细胞后信号转导。后续研究发现NOD 样受体与炎症密切相关，炎症是众多肿瘤发生的重要驱动因素，因此学者开始关注NOD 样受体在肿瘤中的作用〔6，7〕。

Wang 等〔8〕采用免疫组化检测NOD1 信号通路在正常口腔、癌前病变和口腔恶性肿瘤中的表达，结果表明随着NOD1 随着OSCC 的进展而降低。NOD1 的表达与肿瘤分化、淋巴结转移和肿瘤大小密切相关。庄媛媛等〔9〕研究表明NOD1 蛋白表达于细胞质，舌鳞状细胞癌组织中NOD1 蛋白表达率为60.0%显著低于正常舌黏膜对照组表达率80.0%，舌鳞状细胞癌组织NOD1 mRNA 表达量为正常舌黏膜对照组（0.437±0.103）倍。本研究结果与研究报道一致〔8，9〕，NOD1 在OSCC 组织中低表达，同时临床病理参数分析结果说明NOD1 参与OSCC 的发生发展及转移。

庄园等〔10〕研究表明NOD2 蛋白表达于细胞质，舌鳞癌组织NOD2 蛋白表达率为64.0%（16/25），显著低于正常舌黏膜组织的表达率〔84.0%（21/25，P＜0.05）〕。舌鳞癌组织NOD2 mRNA 表达量为正常舌黏膜组织的（0.521±0.080）倍。而且过表达NOD2 可促进Tca8113 舌鳞癌细胞凋亡，抑制其增殖〔11〕。本研究与庄园等〔10〕研究结果一致，说明低表达的NOD2 促进OSCC 的发生。

Da Silva Correia 等〔12〕研究发现NOD1 敲除或者过表达的人乳腺癌细胞（SK-BR）-3、人巨噬细胞趋化因子（MCF）-7 乳腺癌细中，NOD1 均能调控细胞的凋亡通路，而且移植瘤小鼠实验发现NOD1 对于雌激素敏感的肿瘤具有抑制作用，但NOD1 对该细胞系无显著影响。Chan 等〔13〕发现白细胞介素（IL）-8 能够通过趋化因子受体（CXCR）1/2 介导的NOD1/信号通路中受体相互作用蛋白（RIP）2 信号通路进而促进头颈部鳞癌的发展，NOD2 却对此癌症进展无任何影响。Yoon 等〔14〕却证实NOD1 在YD-10B 口腔鳞癌细胞中高表达，NOD2 低表达，且NOD2 激动剂MDP 以剂量依赖的方式抑制YD-10B细胞的增殖。说明NOD1、NOD2 在不同的肿瘤组织、细胞中起的作用不大相同。而本研究说明低表达的NOD1、NOD2 促进OSCC 的发生发展。提示NOD1 及NOD2 可能可作为OSCC 诊断及恶性程度判断的有效指标。