TLR4基因敲除对哮喘小鼠气道炎症的影响①

杨 艳 薛 征（上海中医药大学附属市中医医院，上海 200071）

哮喘是以气道炎症与可变气流阻塞、气道高反应性和气道壁重塑为特征的一种慢性炎症性疾病。尽管随着GINA方案的推广，糖皮质激素、β2受体激动剂、抗胆碱能药物、白三烯调节剂等被广泛用于临床，大多数哮喘患者病情能得到控制，但仍影响着全球4.3%的人口，依旧是全球性的公共卫生问题［1］。研究者们对于哮喘的病理机制尚未完全掌握，是部分哮喘患者病情未受控制、发生率逐年上升的主要原因。近年来研究发现，Th1/Th2失衡并不能完全解释哮喘的病因，另两个功能相对独立的细胞亚群Th17细胞和调节性T细胞（Treg）在哮喘发病中也具有重要意义。Toll样受体4（TLR4）作为模式识别受体家族成员之一，可及时识别病原体相关的分子模式，进一步调节宿主免疫反应，参与过敏性疾病［2］。胸腺基质淋巴生成素（TSLP）是调控过敏性炎症反应的总开关之一，在哮喘、过敏性鼻炎、特异性皮炎中起重要作用。最新文献报道，人类和鼠类在TSLP基因序列上均存在核因子-κB（NF-κB）的结合位点，在致敏原的刺激下，呼吸道上皮细胞TLR2、TLR4、TLR9等激活，可诱导产生TSLP［3-4］。LI等［5］证实，过敏性角膜炎的病理过程可能由TLR4通过TSLP/OX40L信号通路触发，但在哮喘模型中，鲜有报道。因此本研究拟利用TLR4-/-小鼠，建立哮喘模型，观察TLR4敲除对哮喘气道炎症的影响，并探讨其影响是否引起TSLP、OX40L表达改变，从而影响Th1/Th2、Treg/Th17平衡。

1 材料与方法

1.1 材 料4～6周 龄SPF雄 性BALB/c WT和TLR4-/-小鼠，体重18～22 g；OVA、铝佐剂（Sigma）；雾化器、电子天平、苏木精、伊红、DEPC处理水、缓冲液、RIPA组织细胞快速裂解液等（上海基尔顿公司）；Trizol（Invitrogen）；IL-4、IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β、TSLP ELISA试剂盒（Bioswap）；T-bet、GATA-3、RORγt、Foxp3、OX40L抗体（Abcam）；电泳仪（BIORAD）；电转仪（大连竞迈）；酶标仪（芬兰雷勃）；成像系统（Tanon）；Real-time PCR检测仪（ABI）等。

1.2 方法

1.2.1 小鼠哮喘模型建立WT和TLR4-/-小鼠各10只，分别随机分为对照组、哮喘组，即为野生小鼠对照组（WT-NS），野生小鼠哮喘组（WT-OVA），基因敲除小鼠对照组（TLR4-/--NS），基因敲除小鼠哮喘组（TLR4-/--OVA），每组5只。哮喘组小鼠于第1天和第14天腹腔注射1 ml致敏液（0.1 g OVA+0.01 g铝佐剂+1 ml NS）。第21～27天，用5%OVA NS溶液雾化激化，每次40 min，1次/d，连续7 d。对照组腹腔注射致敏液和雾化激发以等量NS溶液替代。末次激发后24 h采集标本。

1.2.2 HE染色观察肺组织病理学改变 取各组小鼠右肺上叶置于10%甲醛固定48 h后，依次进行清洗、脱水、透明处理、浸蜡、石蜡包埋，最后常规切片及HE染色后，通过显微镜拍照，观察肺组织病理变化。

1.2.3 ELISA法检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中细胞因子浓度 结扎右侧支气管，予1.5 ml预冷NS灌洗左侧主支气管肺叶，收集BALF，离心后取上清液，按ELISA试剂说明书进行操作，测定标本中IL-4、IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β、TSLP浓度。

1.2.4 Western blot检测肺组织中相关蛋白表达水平 取各组小鼠右侧支气管、右肺下叶，剪碎并磨制成匀浆，并测蛋白浓度。随后依次上样，电泳，转膜，进行膜上蛋白检测，接着将一抗加入封闭液中稀释，按1∶1 000进行稀释，4℃孵育过夜后，孵育一抗的膜用TBST洗涤3次，随后根据用量，用封闭液稀释二抗，与膜37℃孵育1 min，用TBST洗涤3次，最后使用ECL化学发光试剂盒显示蛋白条带。X线片在图像分析系统上分析，比较GATA-3、T-bet、RORγt、Foxp3、OX40L与GAPDH的相对吸光度值。

1.2.5 Real-time PCR检测肺组织中mRNA水平使用Trizol试剂提取肺组织及支气管中的总RNA后，进行Real-time PCR反应。反应体积为25μl，反应体系含SYBRGreen Mix 12.5μl，上下游引物各0.5μl，cDNA模板2μl，ddH2O 9.5μl。反应条件为：95℃预加热10 min，95℃变形15 s，60℃退火45 s，40个循环后，在60℃保持1 min，使产物延伸完整。数据采用仪器自带软件ABI Prism 7300 SDS Software分析各样本的Ct值，得出GATA-3、T-bet、RORγt、Foxp3 mRNA水平。

1.3 统计学方法 用SPSS24.0统计软件对实验数据进行分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。计量资料统计数据采用±s表示。各组计量资料采用单因素方差分析，并用LSD-t法进行两两比较。

2 结果

2.1 各组小鼠一般行为特征WT-OVA组小鼠雾化后毛发竖立、烦躁掻鼻、呼吸加深、急促、腹肌痉挛，严重者甚至出现大小便失禁、体重减轻等情况。TLR4-/--OVA组小鼠一般行为特征较WT-OVA组明显减轻。WT-NS组和TLR4-/--NS组无上述表现。

2.2 各组小鼠肺组织病理学改变WT-OVA组小鼠肺组织及气管周围可见嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等大量炎症因子浸润，上层基底膜增厚；TLR4-/--OVA组小鼠较WT-OVA组肺组织炎症程度明显减轻，少见炎症因子浸润；WT-NS组及TLR4-/--NS组小鼠气道管腔及周围组织平滑，未见炎症因子浸润。见图1。

图1 各组小鼠肺组织HE染色（×200）Fig.1 HE staining of lung tissue of mice in each group（×200）

2.3 各组小鼠BALF中IL-4、IFN-γ浓度 与WTNS相比，WT-OVA组小鼠IL-4显著升高，IFN-γ显著降低（P＜0.01），与WT-OVA相比，TLR4-/--OVA组小鼠IL-4显著降低，IFN-γ显著升高（P＜0.01），IL-4促进Th0向Th2细胞分化，IFN-γ促进Th0向Th1细胞分化，说明敲除TLR4基因可抑制Th2炎症因子而促进Th1炎症因子释放。见表1。

表1 各组小鼠BALF中IL-4、IFN-γ浓度（±s，ng/ml）Tab.1 Concentration of IL-4 and IFN-γin BALF of mice in each group（±s，ng/ml）

表1 各组小鼠BALF中IL-4、IFN-γ浓度（±s，ng/ml）Tab.1 Concentration of IL-4 and IFN-γin BALF of mice in each group（±s，ng/ml）

Note：Compared with WT-NS，1）P＜0.01；compared with WT-OVA，2）P＜0.01.

Groups WT-NS TLR4-/--NS WT-OVA TLR4-/--OVA IL-4 132.74±8.16 79.49±5.19 336.13±36.761）179.11±26.982）IFN-γ 2 951.14±187.45 3 199.65±42.86 1 040.14±381.181）2 376.58±171.602）

2.4 各组小鼠BALF中IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β浓度 与WT-NS相比，WT-OVA组小鼠IL-6、IL-17、TGF-β显著升高，IL-10显著降低（P＜0.01），与WTOVA相比，TLR4-/--OVA组小鼠IL-6、IL-17、TGF-β显著降低，IL-10显著升高（P＜0.01）。Th17能分泌IL-6、IL-17、TGF-β等炎症因子，IL-10为Treg的代表炎症因子，敲除TLR4基因可调整Th17/Treg细胞平衡。见表2。

表2 各组小鼠BALF中IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β浓度（±s，ng/ml）Tab.2 Concentrations of IL-6，IL-10，IL-10 and TGF-βin BALF of mice in each group（±s，ng/ml）

表2 各组小鼠BALF中IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β浓度（±s，ng/ml）Tab.2 Concentrations of IL-6，IL-10，IL-10 and TGF-βin BALF of mice in each group（±s，ng/ml）

Note：Compared with WT-NS，1）P＜0.01；compared with WT-OVA，2）P＜0.01.

Groups WT-NS TLR4-/--NS WT-OVA TLR4-/--OVA IL-6 68.82±7.22 47.08±9.19 194.69±17.981）111.96±1.292）IL-10 1 314.83±134.10 961.64±50.28 399.03±98.121）710.14±58.602）IL-17 161.94±11.71 125.27±16.98 491.79±32.521）268.80±26.262）TGF-β 113.95±17.79 98.94±11.45 303.26±59.611）169.95±19.932）

2.5 各组小鼠BALF中TSLP浓度 与WT-NS相比，WT-OVA组小鼠TSLP显著升高（P＜0.01），与WT-OVA相比，TLR4-/--OVA组小鼠TSLP显著降低（P＜0.01）。见表3。

表3 各组小鼠BALF中TSLP浓度（±s，ng/ml）Tab.3 Concentration of TSLP in BALF of mice in each group（±s，ng/ml）

表3 各组小鼠BALF中TSLP浓度（±s，ng/ml）Tab.3 Concentration of TSLP in BALF of mice in each group（±s，ng/ml）

Note：Compared with WT-NS，1）P＜0.01；compared with WT-OVA，2）P＜0.01.

Groups WT-NS TLR4-/--NS WT-OVA TLR4-/--OVA TSLP 172.46±45.81 128.92±3.09 561.86±67.491）253.88±14.872）

2.6 各组小鼠肺组织中GATA-3、T-bet蛋白表达及mRNA水 平 与WT-NS相 比，WT-OVA组 小 鼠GATA-3表达水平及mRNA水平显著升高（P＜0.01），T-bet蛋白表达及mRNA水平显著降低（P＜0.01），与WT-OVA相比，TLR4-/--OVA组小鼠GATA-3蛋白表达及mRNA水平显著降低（P＜0.01），T-bet蛋白表达及mRNA水平显著升高（P＜0.01，P＜0.05）。GATA-3可以促进Th2的分化而限制Th1因子分泌，T-bet决定Th1的分化并可将Th2逆转为Th1，敲除TLR4基因可在蛋白及基因水平上调整Th1/Th2失衡。见表4。

表4 各组小鼠肺组织中GATA、T-bet蛋白表达及mRNA水平（±s）Tab.4 Protein expression and mRNA levels of GATA and T-bet in lung tissues of mice in each group（±s）

表4 各组小鼠肺组织中GATA、T-bet蛋白表达及mRNA水平（±s）Tab.4 Protein expression and mRNA levels of GATA and T-bet in lung tissues of mice in each group（±s）

Note：Compared with WT-NS，1）P＜0.01；compared with WT-OVA，2）P＜0.05，3）P＜0.01.

Groups WT-NS TLR4-/--NS WT-OVA TLR4-/--OVA GATA-3 Proteins 0.342±0.085 0.270±0.002 0.795±0.0191）0.397±0.0083）mRNA 0.012±0.003 0.008±0.002 0.023±0.0031）0.015±0.0023）0.396±0.088 0.630±0.045 0.054±0.0081）0.429±0.0553）T-bet Proteins mRNA 0.015±0.005 0.018±0.004 0.006±0.0011）0.012±0.0042）

2.7 各组小鼠肺组织中RORγt、Foxp3蛋白表达及mRNA水平与WT-NS相比，WT-OVA组小鼠RORγt蛋白表达及mRNA水平显著升高（P＜0.01），Foxp3蛋白表达及mRNA水平显著降低（P＜0.01），与WT-OVA相比，TLR4-/--OVA组小鼠RORγt蛋白表达及mRNA平显著降低（P＜0.01），Foxp3蛋白表达及mRNA水平显著升高（P＜0.01，P＜0.05）。Foxp3和RORγt分别为Treg、Th17的正向调节蛋白，敲除TLR4基因能通过调节RORγt、Foxp3蛋白表达及mRNA水平来改变Treg/Th17炎症因子分泌。见表5。

表5 各组小鼠肺组织中RORγt、Foxp3蛋白表达及mRNA水平（±s）Tab.5 Protein expression and mRNA levels of RORγt and Foxp3 in lung tissues of mice in each group（±s）

表5 各组小鼠肺组织中RORγt、Foxp3蛋白表达及mRNA水平（±s）Tab.5 Protein expression and mRNA levels of RORγt and Foxp3 in lung tissues of mice in each group（±s）

Note：Compared with WT-NS，1）P＜0.01；compared with WT-OVA，2）P＜0.05，3）P＜0.01.

Groups WT-NS TLR4-/--NS WT-OVA TLR4-/--OVA RORγt Proteins 0.246±0.079 0.328±0.019 0.603±0.0511）0.448±0.0133）mRNA 0.015±0.003 0.009±0.001 0.032±0.0051）0.021±0.0033）0.466±0.145 0.667±0.053 0.134±0.0811）0.450±0.0133）Foxp3 Proteins mRNA 0.012±0.003 0.016±0.004 0.005±0.002 0.010±0.0022）

2.8 各组小鼠肺组织中OX40L蛋白表达水平与WT-NS相比，WT-OVA组小鼠OX40L蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），与WT-OVA相比，TLR4-/--OVA组小鼠OX40L蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。见表6。

表6 各组小鼠肺组织中OX40L蛋白表达水平（±s）Tab.6 Protein expression of OX40L in lung tissues of mice in each group（±s）

表6 各组小鼠肺组织中OX40L蛋白表达水平（±s）Tab.6 Protein expression of OX40L in lung tissues of mice in each group（±s）

Note：Compared with WT-NS，1）P＜0.01；compared with WT-OVA，2）P＜0.01.

Groups WT-NS TLR4-/--NS WT-OVA TLR4-/--OVA OX40L 0.273±0.112 0.274±0.024 1.055±0.1331）0.719±0.0582）

3 讨论

TLR4是一种跨膜蛋白，属于模式识别受体家族。机体受到外界微生物或环境中不利因子侵袭后，TLRs可将识别到的微生物或内源性分子相关信号传递给下游蛋白激酶，诱导转录因子激活，触发体内T细胞介导的免疫反应，释放炎症因子及介质［6-7］。目前发现哺乳动物中存在11种TLRs，只有TLR2和TLR4才能触发转录因子易位，激活免疫相关基因，诱导炎症反应，表明TLR2和TLR4可能与哮喘最相关［8-9］。最新一项研究发现，用OVA联合脂多糖（LPS）对TLR2-/-及TLR4-/-小鼠建立哮喘模型，TLR2-/-小鼠气道上皮中杯状细胞增殖，气道黏膜下层炎症细胞膨胀，然而，TLR4-/-小鼠肺组织未见明显病理改变［10］；用OVA、LPS联合亚洲沙尘（ASD）同样对两组小鼠造模发现，TLR2-/-小鼠肺部杯状细胞增殖率和炎症细胞炎症率显著升高，IL-5、IL-6、IL-13、TNF-α等炎症因子蛋白表达水平明显上调，与TLR2-/-小鼠相比，TLR4-/-肺部病理改变及炎症因子表达方面均较轻，考虑TLR2-/-小鼠能表达TLR4蛋白，LPS可以通过TLR4信号途径激活小鼠的Th2反应，TLR4与TLR2相比，识别的微生物信号可能更广泛。先前的研究报道，OVA诱导的哮喘小鼠血液单核细胞中TLR4 mRNA表达水平增加，小剂量的LPS刺激OVA致敏后的小鼠，可通过TLR4信号诱导Th2炎症反应，促进IL-4、IL-5的释放［11-12］。TANG等［13］研究表明使用TLR4拮抗剂治疗过敏性鼻炎哮喘综合征小鼠，可通过降低BALF中IL-4、IL-5、IL-13浓度及减少单核细胞浸润，调节嗜酸性粒细胞的积聚明显改善下气道症状。越来越多的证据表明，靶向TLR4信号通路作为新的哮喘治疗靶点具有巨大的潜力。本研究结果显示，TLR4-/-哮喘小鼠比野生哮喘小鼠肺部炎症反应轻，嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等炎症细胞浸润不明显，IL-4浓度、GATA-3蛋白水平显著降低，IFN-γ浓度、T-bet蛋白水平显著上升，提示TLR4基因敲除可调整Th1/Th2失衡，扭转Th2优势化，使肺组织处于低炎症状态。Treg/Th17的稳态在维持肺免疫方面具有重要意义，Th17/Treg失衡与哮喘、过敏性鼻炎等炎症性和自身免疫性疾病的发病机制有关［14］。IL-6是控制Th17/Treg平衡的关键细胞因子。结果发现，敲除TLR4基因除了可调整Th1/Th2失衡外，还能通过降低IL-6、IL-17、TGF-β浓度，RORγt蛋白表达及mRNA水平，提高IL-10浓度，Foxp3蛋白表达及mRNA水平恢复Treg/Th17平衡。

TSLP是一种与IL-7密切相关的新型的Ⅰ型细胞因子，主要由皮肤、肠道和肺等屏障表面的上皮细胞表达，诱导Th0分化为Th2，启动炎症反应。哮喘患儿外周血中TSLP水平明显高于正常查体患儿，且与肺功能水平呈负相关，提示TSLP在哮喘的发病机制中起着至关重要的作用［15］。目前，过敏性角膜炎模型中TSLP主要由角膜上皮细胞里的TLRs诱导的观点已被公认［16］。实验结果显示，TLR4-/-基因敲除小鼠TSLP浓度相比于野生模型组小鼠显著降低，提示在哮喘中TSLP可能由TLR4触发。此外，大量研究表明，TSLP很大程度上发挥作用是通过树突状细胞（DC）上的OX40配体（OX40L）来实现的［17-18］。这与本研究发现一致，野生模型组小鼠TSLP浓度及OX40L蛋白表达水平较空白组显著升高，TLR4-/-基因敲除小鼠TSLP浓度随着OX40L水平降低。OX40是TNFR家族成员，主要表达于活化的T淋巴细胞，OX40L为OX40的配体，在活化抗原提呈细胞、内皮和活化T细胞上存在。OX40与OX40L的结合向新激活的效应T细胞传递了强烈的共刺激信号，增强Th2的反应，IL-6与OX40L协同作用，诱导Th2分化的同时也可阻断Treg细胞的作用［19-20］。

综上所述，发现在哮喘模型中，TLR4-/-基因敲除可以显著减轻肺部炎症细胞浸润，可能与TSLP/OX40L水平减低，从而调节Th1/Th2、Treg/T17失衡有关，为后续深入研究TLR4在哮喘中的作用、临床治疗靶点及策略提供前期基础证据，然而确切的分子机制有待下一步研究。