重组禽流感病毒三价灭活苗免疫现状及效果评价

沈亚菊，冯高乐，邵 高，朱 赞，张志方，夏天中，林瑞平*

(1.平湖市畜牧兽医站，浙江 平湖 314200；2.平湖市动物卫生监督所)

高致病性禽流感在世界范围内的家禽和野鸟中广泛流行[1]，给我国的养禽业造成了巨大的损失。当前我国家禽H5亚型禽流感主要流行H5N6亚型，少量H5N1亚型，偶尔分离到H5N3、H5N8和H5N2等，在野鸟和鸭上H5N8的发生呈增多趋势，病毒HA基因进化分支有3个，主要流行的是呈全国性分布的2.3.4.4d分支，其次为在不同区域的省份出现的2.3.2.1d分支，个别病毒属于野鸟分支。H7亚型禽流感流行主要以H7N9为主，偶尔分离出H7N8、H7N7、H7N3和H7N2等亚型，病毒HA基因分为以鸡为主的H7N9分支和鸭源H7病毒，H7N9病毒随时间出现了不同的小分支[1-3]。为有效防控高致病性禽流感，我国采取了强制免疫政策。2020年，农业部批准了针对高致病性禽流感病毒的最新疫苗“重组禽流感(H5+H7)三价灭活苗(H5N1 Re-11株+Re-12株，H7N9 H7-Re3株)”和“重组禽流感(H5+H7)三价灭活苗(H5N2 rSD57株+rFJ56株，H7N9 rLN79株)”。为了解浙江平湖市规模鸡场禽流感防控现状及免疫情况，本课题组对部分养鸡场做了问卷调查，并对其中部分鸡场进行了高致病性禽流感免疫抗体水平和病原学检测，另选择某鸡场开展政府采购重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活苗(H5N1 Re-11株、Re-12株和H7N9 H7-Re3株)免疫试验。

1 材料与方法

1.1问卷调查 通过问卷调查的形式，对8户规模鸡场进行了问卷调查，分别编号肉鸡1、肉鸡2至肉鸡8。

1.2血清学和病原学检测 全血样品来自8个使用重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活苗(H5N1 Re-11株Re-12株 H7N9 H7-Re3株)免疫的养禽场，在免疫后30 d以上采集，每场采集30份，共分离血清239份，同时采集210份咽喉和泄殖腔拭子。

1.3免疫试验

1.3.1试验疫苗 政府采购重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活苗(H5N1 Re-11株、Re-12株和H7N9 H7-Re3株)，哈药集团生物疫苗有限公司生产，批号202041，生产日期20200906。

1.3.2试验方法 试验用鸡来自浙江省平湖市新埭镇某养鸡场，27日龄快速型黄羽肉鸡120羽。免疫前先测定鸡群高致病性禽流感母源抗体水平。随机选择60羽进行重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活苗一次免疫试验，鸡右侧胸部肌肉注射疫苗0.5 mL/羽，于免疫后14 d、28 d、42 d采血进行抗体监测。另择60羽进行重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活苗二次免疫试验， 首免27日龄，间隔30 d加强免疫一次，鸡右侧胸部肌肉注射疫苗0.5 mL/羽，首免后14 d、28 d和二免后14 d、28 d、42 d采血进行抗体监测。

1.4检测方法 依据《高致病性禽流感诊断技术》(GB/T 18936-2020)，采用HA和HI试验，对H5和H7亚型免疫抗体进行检测和结果判定。HI抗体滴度≥42为免疫抗体合格，群体阳性率≥70%为合格。病原学检测采用禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测。

1.5诊断试剂 禽流感病毒H7亚型血凝抑制试验抗原(H7-Re3株)、禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原(H5N1 Re-11株和Re-12株)和阳性血清均由哈尔滨维科生物技术开发有限公司生产，批号分别为：2021001、2019009、2019007。禽流感病毒通用型荧光 RT-PCR检测试剂盒(B盒)，哈尔滨国生生物科技股份有限公司生产，批号：20200820。

2 结果

2.1问卷调查

2.1.1养殖户基本情况 本次调查的8个鸡场均是家庭饲养场，鸡场场主全部是男性，年龄45-59岁4人占50%，18-44岁3人占37.5%，60-69岁1人占12.5%。文化程度小学或初中学历4人占50%，高中或中专学历2人占25%，没上过学和大专及以上各为1人，分别占12.5%。从事养鸡5-15年5人占62.5%，5年以下2人占25%，15年以上1人占12.5%。

2.1.2养殖规模 8个鸡场均是饲养肉鸡，年出栏肉鸡1万-5万羽占37.5%，10万羽以上和1万羽以下各占25%，5-10万羽的12.5%。鸡场死淘率2%-5%为5个占62.5%，5%-8%为2个占25%，15%以上为1个占12.5%。

2.1.3鸡场防疫条件 本次调查的8个鸡场周边500 m内有村民住房集聚区，3个鸡场周边500 m内有养禽场。除了1个鸡场门口有消毒池，8个鸡场几乎没有生物安全防护措施，场内无门禁、围栏围墙等物理隔离设施，门口缺乏消毒池或消毒垫，进场无洗澡更衣、更换胶鞋等专门区域。4个鸡场的生产区和生活办公区隔开，1个鸡场的供料道与出粪道分开，各养殖栋舍出入口均未设有消毒垫。4个鸡场的进场车辆、外来人员需要消毒，5个鸡场采取定期全场喷雾消毒或石灰撒播。8个鸡场均未设专门的兽医诊断室和配备体温计、常规解剖器械等诊疗工具，6个鸡场配有疫苗存储专用冰箱。

2.1.4禽流感临床知识 本次调查8个鸡场场主对高致病性禽流感临床症状知晓率，知晓脚鳞出血、鸡冠出血或发绀、头部和面部水肿发紫的5个占62.5%，知晓急性发病死亡、神经症状的4个占50%，知晓肌肉和其他组织器官广泛性严重出血的2个占25%，知晓绿色稀便2个占25%。

2.1.5禽流感免疫 8个鸡场均进行了重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗(H5N1 Re-11株、Re-12株和H7N9 H7-Re3株)免疫，4个鸡场进行鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗免疫，另1个鸡场进行鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗免疫。使用的禽流感疫苗来自哈药集团、青岛易邦的5个，来自肇庆华农、湖南中岸的各1个。8个鸡场均开展禽流感免疫抗体检测，且对免疫效果满意。免疫程序多样化：10日龄首免+20日龄二免，7日龄首免+30日龄二免，9日龄首免+30日龄二免，10日龄首免+30日龄二免，15日龄首免+30日龄二免。免疫剂量或按说明书推荐或比推荐剂量增加0.5倍。8个鸡场对家禽疫苗免疫注意事项及具体操作熟练掌握且认真执行，对本市的高致病性禽流感防控政策表示满意。

2.1.6鸡场盈利 各鸡场盈利水平不一，肉鸡平均盈利高的5-6元/羽，低的2-3元/羽，甚至亏损5元/羽。

2.2血清学和病原学检测

由表1可以看出8个肉鸡场的禽流感H5 亚型(Re-11株、Re-12株)及 H7 亚型(Re-3株)免疫抗体合格率均大于70%，达到国家规定的标准，免疫效果较好。210份咽喉和泄殖腔拭子使用禽流感通用荧光 RT-PCR 试剂盒进行检测，结果均未检测到禽流感病原学阳性样品。

表1 鸡场的禽流感免疫抗体检测结果

2.3免疫试验结果 27日龄时试验鸡群H5亚型Re-12株和H7-Re3株母源抗体完全消失，H5亚型Re-11株母源抗体的平均滴度为0.682，基本消失。首免14 d后3个疫苗株的免疫抗体平均滴度达62以上，到28 d时3个疫苗株的免疫抗体平均滴度达到高峰，均在92以上。二免14 d后3个疫苗株的免疫抗体平均滴度经过短暂小幅下降后上升至高峰水平。

表2 禽流感免疫后抗体消长规律

3 分析

问卷调查结果显示，半数以上养殖户年龄偏大、文化程度偏低，数字畜牧应用系统养殖管理使用、智能手机养殖APP操作困难，严重影响数字化畜牧业养殖档案电子台帐推行。有的肉鸡场生物安全防控体系薄弱，没有设立门岗、管理制度严格控制鸡场与外界人流、物流，尽管有一套自己的免疫程序和消毒方法，基本做到单一品种饲养、全进全出、不同批次间清栏消毒空置净化鸡舍，但考虑经济因素较多，会根据周边疫病流行情况、市场行情来调整，执行时可能存在不彻底、不规范。本调查发现各规模鸡场禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗首免日龄7-10日龄、15日龄、30日龄均有，所用免疫程序比较混乱。临床上血清学检测结果8个肉鸡场的禽流感H5 亚型(Re-11株、Re-12株)及 H7 亚型(Re-3株)免疫抗体合格率均大于70%，达到国家规定的标准，可能与采样时间距离末次免疫时间长短有关。8个肉鸡场的禽流感病原学阴性说明鸡群未受野毒感染。

免疫试验结果表明27日龄肉鸡H5N1Re-11、H5N1Re-12、H7N9 H7-Re3三种母源抗体基本消失，这与刘婷婷[4]等研究结果相似。说明禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗的首免日龄不要晚于27日龄，否则会增加野毒感染风险。重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活苗首免、二免后鸡群H5N1 Re-11、H5N1 Re-12、H7N9 H7-Re3三种抗体的整体消长趋势基本同步。

本研究中8个规模鸡场血清学结果和小群免疫试验结果显示，重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活苗(H5N1 Re-11株Re-12株 H7N9 H7-Re3株)是有效的，60日龄出栏肉鸡禽流感免疫一次，100日龄出栏肉鸡需在首免30 d后加强免疫一次，这样出栏检测时肉鸡具有较高的抗体效价，能有效的降低鸡群感染H5和H7亚型禽流感病毒的风险。