柑橘CLas 和CYVCV 双重PCR 检测体系的建立及应用

王培育， 杨 学

(三明市农业科学研究院， 福建沙县365051)

柑橘(Citrus reticulataBlanco)又名宽皮橘、黄橘，是芸香科(Rutaceae)柑橘属(Citrus)的常绿小乔木。 柑橘广泛种植于北纬35°以南的区域，目前中国是柑橘最大的生产国，广西是中国最大的柑橘产区(刘印璇，2019)。 柑橘营养丰富，色香味兼优，既可鲜食又可加工成以果汁为主的各种加工制品(沈晓晖，2018)。 柑橘易受多种病害的影响，其中以柑橘黄龙病和黄化脉明病最为常见。

柑橘黄龙病是一种由韧皮部杆菌(CandidatusLiberibacter)引起的，对柑橘具有毁灭性的病害，可严重影响柑橘产量和品质，甚至造成柑橘树枯死，能够侵染包括柑橘属、枳属、金柑属和九里香在内的多种芸香科植物(Guzet al，2020)。 我国的柑橘黄龙病主要是由柑橘黄龙病菌亚洲种(CandidatusLiberibacter asiaticus，CLas)引起的。 柑橘木虱和带病苗木或带病接穗是远距离传病的主因，往往使无病的新区变成病区，而柑橘长期以来通过扦插或嫁接的方式进行种苗繁育，极易造成大面积带病植株的传播。 在商业化种植过程中，通常在柑橘发现病害时，将整株植株直接销毁(Dinget al，2020；Zhou，2020；肖翠等，2019)。 柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus，CYVCV)属于印度柑橘病毒属(Mandarivirus)，虽然80%的植物病毒病依赖于媒介昆虫传播，但前期研究未发现介导该病毒在柑橘间进行传播的昆虫(刘翠花等，2016；刘惠芳，2018)。 有研究发现，该病一旦发生，可在短时间内迅速传播，主要传播方式是嫁接传播，且传毒效率较高，苗木带毒可实现远距离传播(张艳慧，2018)。 因此，培育不含CLas和CYVCV 的柑橘苗，并及早发现含有CLas 和CYVCV 的柑橘植株，是防控柑橘黄龙病和黄化脉明病的关键。

虽然受CLas 和CYVCV 感染的柑橘植株可表现出明显特征，但并不排除表型良好的植株不含有CLas 和CYVCV，染病植株需经过长短不一的潜伏期后才表现症状，待其症状明显时，防治难度及经济损失增大(Zhou，2020；刘翠花等，2015)。 目前，对柑橘黄龙病和黄化脉明病已有大量研究，但其检测技术仍较为复杂，且存在假阴性和假阳性现象(胡浩等，2006)。 本研究通过同时检测CLas 和CYVCV，可大大提高检测效率，缩短检测时间和检测成本，并且通过对特异性引物的目的片段进行检测，能够排除检测结果出现假阴性和假阳性的产生。 研究结果可为柑橘田间病毒的快速检测和后期病害防治及脱毒技术研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验位于三明市尤溪柑橘园，选取5 年生以上的柑橘植株， 采集感染有柑橘黄龙病菌(CLas)、柑橘黄化脉明病毒(CYVCV)以及健康柑橘苗的叶片，其中以PCR 检测后呈现阴性的健康柑橘苗叶片为阴性对照。 采集的柑橘叶样品均经液氮处理后置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 引物设计

根据NCBI 数据库中已登录的CLas 16S 和CYVCV 外壳蛋白(coat protein，CP)以及内参CTACT基因的保守核苷酸序列，使用DNAMAN 软件设计CLas 16S 和CYVCV 的特异性引物各2 对，内参CTACT基因的特异性引物1 对(表1)，以上引物均由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

表1 引物序列和预期目的片段大小Table 1 Primer sequence and expected target fragment size

1.3 总RNA 的提取及cDNA 的合成

采用王培育等(2018)改良的Trizol UP RNA 方法提取叶片RNA，用酶标仪检测RNA 浓度，利用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA 质量，使用Prime ScriptTMRT-PCR Kit 反转录试剂盒(大连TAKARA 生物公司)合成cDNA，反转录后将各模板样品稀释至10 ng·L-1，保存于4 ℃冰箱备用。

1.4 供试样品PCR 扩增

PCR 扩增体系参照王培育等(2019)的研究方法，取25 μL PCR 产物进行检测，以健康柑橘苗叶片作为阴性对照，于1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后拍照保存。

1.5 灵敏度检测

采用1.4 中的PCR 体系对柑橘样品进行检测，样品的cDNA 原液按10 倍梯度进行稀释，依次稀释cDNA 原液浓度为100～10-5。 随后在PCR 仪上进行扩增，检测其灵敏度。

2 结果与分析

2.1 感病和健康柑橘样品表型

采集的柑橘样品，对其健康和感病叶片拍照记录。 如图1 所示，图1A 为健康的柑橘叶片，叶片平整，脉络清晰，叶色翠绿且有光泽度。 图1B 为感染柑橘黄龙病的叶片，出现斑驳黄化、均匀黄化及缺锰、锌状黄化；其果小、畸形，着色异常如红鼻子果、青头果等，表面无光泽。而在光照条件下，可以观察到图1C 为感染黄化脉明病的柑橘叶片，叶脉发黄透亮，周边叶肉有黄斑，后期叶片皱缩；有些柑橘品种感病后还常伴随着褪绿、花叶等。 该病在新叶上表现出症状，且表现的脉明症状会随着叶片的老化逐渐减弱。 图1D 为同时感染了柑橘黄龙病和黄化脉明病的柑橘叶片，表现出叶片斑驳黄化，叶脉明显且叶片皱缩现象。

图1 健康和感病柑橘叶片表型Figure 1 Phenotype of healthy and susceptible in Citrus leaf

2.2 应用PCR 检测柑橘CLas 和CYVCV 的感病情况

PCR 扩增约2 h 后，将扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后观察拍照，结果如图2 所示。 1 号泳道以H2O 为模板，无条带扩增；2 号泳道为2 对CLas 和1 对CTACT特异引物组合，以感染黄龙病病叶cDNA 为模板，同时扩增得到840、748 bp CLas 特异片段和120 bp 内参CTACT基因片段；3 号泳道为2 对CYVCV 和1 对CTACT特异引物组合，以感染黄化脉明病病叶cDNA 为模板，同时扩增得到447、325 bp CYVCV 特异片段和120 bp 内参CTACT基因片段；4 号泳道为2 对CLas、2 对CYVCV 和1 对CTACT特异引物组合，以同时感染黄龙病和黄化脉明病病叶cDNA 为模板，除扩增出120 bp 内参CTACT基因片段，还同时扩增得到840、748 bp CLas 特异片段和447、325 bp CYVCV 特异片段；5 号泳道以健康叶片cDNA 为模板(阴性对照)，使用表1 所述的5 组引物组合，采用1.4 中PCR 反应体系及扩增条件，并进行双重检测，只扩增出120 bp 的内参条带，排除了假阳性和假阴性产生的可能。 结果表明，待测叶片感染了 CLas 和 CYVCV。

图2 PCR 检测柑橘CLas 和CYVCVFigure 2 PCR detection of citrus CLas and CYVCV

2.3 灵敏度检测

分别以100～105稀释倍数的cDNA 液为模板进行目标片段PCR 扩增，扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。 检测结果如图3 所示，以CLas 16S F118、CLas 16S R866、CLas 16S R958 组合分别可以扩增出 748 和 840bp 特异性条带；CYVCV CP F41、CYVCV CP F163、CYVCV CP R488 组合分别可以扩增出447 和325 bp 特异性条带；CTACTF460、CTACTR580组合可扩增出120 bp 特异性条带。 结果表明，待测样品含有CLas 和CYVCV 且cDNA 合成质量可用。 图 3 中泳道 1～5 分别为待测样品 cDNA 在原液及稀释 101、102、103、104倍条件下扩增出的CLas、CYVCV 及CTACT目的条带；泳道6 为待测样品cDNA 在稀释105倍条件下还能扩增出CYVCV 目的条带。 结果表明，该特异性引物组合不仅能够排除假阳性和假阴性产生，还具有高度灵敏性。

图3 PCR 检测柑橘CLas 和CYVCVFigure 3 PCR detection of citrus CLas and CYVCV

3 结论与讨论

柑橘产业深受病害问题的困扰。 迄今为止，我国的柑橘病害有300 多种，分为侵染性病害和非侵染性病害两大类。 在病菌类病害中，以黄龙病最严重，曾造成大批柑橘园毁害，使用常用药剂防治，效果不佳(Bove 等，2011)。 培育脱毒柑橘母本树和苗木以及进行抗病品种选育工作时，对其进行病原菌检测，在病害防治过程中起到至关重要的作用。 PCR 检测方法虽然具有较高的特异性和灵敏度，但其检测技术复杂、效率低，具有一定的局限性。 因此，多重PCR技术在植物病原菌检测方面得到大力地推广应用(张婧颖，2016)。 刘欢等(2016)利用多重PCR 技术一次性扩增出番茄烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、番茄斑萎病毒(TSWV)和马铃薯X 病毒(PVX)的特异性片段；匡云波等(2018)运用多重PCR 技术建立PCR检测方法，可快速、稳定、准确地检测太子参蚕豆萎蔫病毒(BBWV2)和芜菁花叶病毒(TuMV)；焦楠等(2019)建立了西番莲夜来香花叶病毒(TeMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)的双重 PCR 检测体系。 本方法利用双重PCR 技术进行CLas 和CYVCV 检测，大大提高检测效率，缩短检测时间和检测成本；同时，对CLas 和CYVCV 特异性引物的目的片段进行检测，可排除假阳性的产生，对内参基因CTACT特异性引物的目的片段进行检测，能够排除检测结果出现假阴性。

本试验在前人研究基础上，首次建立起能同时检测柑橘CLas 和CYVCV 的测体系。 以单一PCR 检测为基础，设计特异性引物，对样品柑橘进行检测，灵敏度试验显示建立的PCR 体系具有较高的灵敏性，能够检测到10-5mg 的组织量，这是PCR 技术在柑橘病原菌检测上的应用，对培育脱毒柑橘母本树和苗木以及进行抗病品种的选育具有重要意义。