外源芸苔素内酯对不同基因型杂交稻开花期耐热性的影响

宋佳谕 陈宇眺 洪晓富 闫 川

(浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所，浙江 杭州 310021)

孕穗期和开花期是水稻穗发育和花粉受精的重要时期，该时期的气候条件与产量形成有直接关系[1-2]。近十几年，在温室效应影响下，全球气温持续升高，我国长江中下游流域7月中旬至8月中旬经常受到副热带高压控制，持续高温天气频繁发生。数据显示，2003年、2014年、2016年盛夏，长江中下游部分稻区连续数日温度达40℃以上，热害导致水稻穗发育受阻和颖花育性下降，造成严重减产[3-4]。目前，由于无法采取防御措施避免高温胁迫，因此耐热品种选育、外源激素喷施和改善水肥条件等已成为抵抗热害发生的主要方法。

近几年，杂交稻以其高产优质的特点被广泛种植[5-6]。长江中下游单季稻区主要以杂交籼稻和籼粳杂交稻为主，根据籼型基因频率，籼粳杂交稻又分为偏籼型和偏粳型。不同遗传背景的杂交稻对高温胁迫的耐受性不同，籼稻穗发育和开花期最适宜温度为33.1℃，粳稻为26.5℃[7]。籼粳杂交稻具有双亲遗传特性，因此，耐热性表现也存在差异。有研究显示，水稻耐热性与籼粳性高度相关，且遗传背景偏籼的杂交稻品种通常较偏粳型杂交稻耐热性强[8]。受地域影响，长江中下游和华南稻区的杂交稻种植主要以遗传背景偏籼的杂交籼型和籼粳杂交稻为主，受热害影响较为严重[9]，因此，提高杂交水稻耐高温能力是稳定长江中下游稻区高产稳产的重要途径。

水稻等作物在高温胁迫下的生存能力取决于对活性氧和甲基乙二醛(methylglyoxal,MG)的清除作用[10-11]。活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量通常受到抗氧化酶[超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidases，GPX)、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)等]和非酶抗氧化剂[还原型抗坏血酸(ascorbic acid，AsA)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)等]调控[12]。MG是在应激过程中产生的毒性化合物，过量的MG可破坏抗氧化防御系统，导致细胞死亡。甲基乙二醛酶系统(methylglyoxal enzyme systemⅠ and methylglyoxal enzyme systemⅡ，GlyⅠ和GlyⅡ)可将MG还原为D-乳酸，降低细胞氧化负担[13]。BR是一种新型绿色环保植物生长调节剂，与水稻穗发育和籽粒充实度紧密相关，且对提高多种非生物胁迫抗性具有显著作用[14-15]。研究显示，外施BR可提高SOD、CAT等抗氧化酶活性和AsA、GSH等非酶抗氧化剂含量，并增加碳水化合物积累，促进叶片的光合速率，以提高水稻耐热性[16-17]。但BR对水稻高温抗性研究受对照材料、处理条件等多方面因素影响，在不同类型水稻品种间作用效果差异较大。目前，有关对比不同遗传背景杂交稻对BR缓解热害能力的差异及生理机制的报道相对较少。本研究以浙江省偏北部地区主栽的杂交籼稻和籼粳杂交稻品种为材料，在开花期进行高温处理，对比分析喷施BR前后，不同遗传背景杂交稻对高温耐受性的影响，并从产量、花粉活力、抗氧化能力、解毒能力等方面进行分析，以期为缓解杂交稻开花期的高温损伤，保障热害条件下的稳产高产提供理论依据和实践经验。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试验地概况

本研究选用不同遗传背景的杂交型水稻(OryzasativaL.)作为试验材料，分别为杂交籼稻：中浙优1号(ZZY1)和中浙优8号(ZZY8)、偏籼型籼粳杂交稻：甬优9号(YU9)和甬优15号(YU15)、偏粳型籼粳杂交稻：浙优18(ZY18)和甬优12(YU12)，共6个品种。在2019和2020年进行盆栽试验，分别种植于浙江省杭州市余杭区示范基地和浙江省农业科学院试验基地。土壤基础肥力为：pH值7.3、有机质17.80 g·kg-1、全氮1.24 g·kg-1、速效磷47.00 mg·kg-1，速效钾98.00 mg·kg-1。

1.2 试验设计

试验于6月20日播种，7月1日选取生长一致的秧苗移栽于盆栽桶(直径30 cm，装15 kg过10目筛后的土壤)，每个品种18盆，每盆3株。每品种设置常温对照组CK(30℃，无BR)、高温对照组HT(40℃，无BR)及高温激素处理组HTB(40℃+0.15% BR)共3个处理。水稻植株生长至抽穗开花期按照生育期分批移入人工气候室，光照(昼5 000 LUX)，湿度(70%)条件一致。高温处理设置，6：00―9：00为35℃，9：01―17：00为40℃，17：01―22：00为35℃，22：01―次日5：59为33℃。常温处理设置，6：00―9：00为25℃，9：01―17：00为30℃，17：01―22：00为25℃，22：01―次日5：59为23℃[18]。高温处理与BR处理同时进行，移入当天于7：00―8：00喷施浓度为0.15 mg·L-1的BR溶液，喷至溶液于液体叶面滑落为止。高温处理时间为10 d，处理完成后将盆栽移出人工气候室，放回自然条件下继续生长。盆栽移栽前一天施用3.0 g复合肥作为基肥，移栽7 d后施用0.5 g尿素为分蘖肥，移栽40 d后施用1.8 g复合肥为穗肥，复合肥含量为N∶P2O5∶KO2=15∶15∶15。水分条件控制同田间管理措施一致。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 产量及其构成 成熟期每个处理调查所有植株总有效穗数，计算平均分蘖数。种子脱粒后用水选法选出饱粒与秕粒，80℃烘干至恒重，调查每穗粒数、结实率和千粒重，并将籽粒晒干统一换算成标准含水量(14%)后计算产量。通过计算CK和HT的结实率获得耐热系数，比较不同遗传背景杂交稻的耐热性[19]；通过计算HTB和HT结实率，获得恢复系数，比较高温下不同遗传背景杂交稻遭受热害损伤的恢复能力[19]：

耐热系数=(HT结实率/CK结实率)×100%

(1)

恢复系数=(HTB结实率/HT结实率)×100%

(2)

1.3.2 花粉活力 在水稻盛花期，连续3 d于上午11：00―12：00剪取稻穗，每个处理取3株，轻轻抖落花粉于滴有1%碘化钾溶液的载玻片上，用镊子捣碎花粉并剔除花药等组织，盖玻片压片后，移入显微镜观察花粉的染色结果，每个品种观察3株。花粉粒呈现为饱满的实心黑色原型为可育，呈现空心圆形为不可育。根据公式计算植株的花粉活力[20]：

花粉活力=视野内可育花粉数/视野内总花粉数×100%

(3)

1.3.4 RNA提取和实时荧光定量 高温和BR处理后第10天，取每个处理的水稻剑叶，于-80℃保存备用，用于APX基因OsAPXI[21]、乙二醛酶基因OsGLYI[22]、过氧化氢酶基因OsCATB[23]和GPX基因OsGPX3[24]的相对表达量检测。

采用RNA提取试剂盒(CAT9637，TaKaRa，日本)提取基因组RNA，采用逆转录试剂盒(CATRR420，TaKaRa，日本)进行cDNA反转，采用荧光定量试剂盒(RR420A，TaKaRa，日本)进行荧光定量PCR。利用Applied Biosystoms 7500 Real Time PCR 进行PCR扩增，引物如表1所示。OsActin为内参基因，采用2-ΔΔCT方法计算结果[25]。

表1 实时荧光定量PCR引物序列 Table 1 Primers used for quantitative real-time PCR

1.4 数据分析

采用SPSS 20的Duncan’s进行差异显著性分析，显著水平P=0.05；采用SigmaPlot 12.0进行图型绘制，AI进行图像组合排版。同一类型杂交稻所获得产量数据和花粉活力为2个品种两年数据单独计算后的平均值。AsA、GHS含量和GlyⅠ酶活性测定标准统一使用空白孔调零，于波长450 nm处依序测量各孔吸光度(OD 值)。荧光定量结果为同一类型杂交稻2020年所获数据，每个类型杂交稻选1个品种进行定量分析。

2 结果与分析

2.1 产量及其构成因子

常温下，杂交籼稻单株产量低于籼粳杂交稻，而偏粳型籼粳杂交稻单株产量显著高于其他品种(图1-A)。由表2可知，高温导致不同遗传背景的杂交稻单株产量均显著下降，其中杂交籼稻中的两个品种平均单株产量较CK下降25.07%，显著低于偏籼型籼粳杂交稻单株产量(下降率35.84%)和偏粳型籼粳杂交稻(下降率54.13%)。由图1-B可知，常温下杂交籼稻结实率较高，而籼粳杂交稻之间无显著差异。开花期高温导致结实率显著下降，杂交籼稻、偏籼型和偏粳型籼粳杂交稻平均下降率分别为23.88%、28.59%和43.45%，杂交籼稻结实率显著高于偏籼型和偏粳型杂交稻，其中偏粳型杂交稻受热害影响最严重。每穗粒数受高温影响显著降低(表2)。开花期高温对水稻千粒重和有效穗数无显著影响。

表2 高温和BR处理对不同类型杂交稻单株产量及构成因子的影响Table 2 Effect of BR application on rice yield and its components of hybrid rice with different genetic background under high temperature.

由图2可知，不同遗传背景的杂交稻耐热系数不同，其中杂交籼稻耐热系数(0.73)高于籼粳杂交稻，且籼粳杂交稻中以偏粳稻型杂交稻耐热性最差(偏籼型0.67，偏粳型0.47)，表明杂交籼稻具有较强的高温耐受性。

高温处理下喷施1.5% BR溶液后，所有品种单株产量均显著提高，但不同遗传背景的杂交稻变化幅度不同。偏粳型籼粳杂交稻上升率最高，两年平均值达到49.20%，尽管喷施BR后产量显著高于高温未喷施组(HT)，但与常温对照(CK)相比仍显著下降；偏籼型籼粳杂交稻和型杂籼稻两年平均上升率分别为30.08%和24.67%，其中ZZY8和YU15在连续两年的试验中单株产量与常温对照组相比无显著差异，而ZZY1仅在2019年试验中单株产量达到常温对照水平。从产量构成因素分析，喷施BR后结实率相对于高温未喷施组显著上升，其中偏籼型籼粳杂交稻在两年的结果中，结实率均达到常温对照水平；尽管杂交籼稻喷施BR后结实率显著上升，但是仍显著低于常温对照；在喷施BR后，偏粳型杂交稻ZY18在2020年、YU12在2019年中，喷施BR组与常温对照组的结实率无显著差异。另外，偏籼型杂交稻结实率显著高于偏粳型杂交稻和杂交籼稻(图1-B)。高温下喷施BR对每穗粒数影响较小，除ZZY1在2019年中表现显著上升，其他品种在BR喷施前后每穗粒数均无显著差异。BR处理对千粒重和单株穗数影响均较小。

注：不同小写字母表示每个处理不同品种间差异显著(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate significant difference among different varieties in each treatment at 0.05 level.图1 高温和BR作用下不同遗传背景杂交稻的产量和结实率Fig.1 Effect of BR application on yield and seed setting rate of hybrid rice with different genetic background under high temperature

由图2可知，偏粳型杂交稻恢复系数高于其他品种(偏粳型2.00，偏籼型1.43，杂交籼型1.23)，表明偏粳型籼粳杂交稻在BR作用下，缓解热害损伤效果最明显，表现在BR喷施后结实率和单株产量上升率最高。

注：不同小写字母表示不同类型杂交稻间差异显著(P<0.05)Note:Different lowercase letters indicate significant difference among different types of hybridrice at 0.05 level.图2 不同遗传背景杂交稻的耐热系数和恢复系数Fig.2 Temperature tolerance and restitution coefficient of hybrid rice with different genetic background

2.2 高温和激素处理影响花粉活力

水稻结实率与开花期花粉受精能力直接相关，高温影响花粉活力，降低花粉受精率，导致结实率下降。由图3可知，杂交籼稻和籼粳杂交稻在常温条件下花粉活力约为97%～100%，且品种间无显著差异(图4)。高温处理后，所有品种花粉活力均显著降低，杂交籼稻比常温对照下降4.76个百分点，偏籼型和偏粳型籼粳杂交稻花粉活力分别下降10.68和11.21个百分点。高温下喷施BR后，杂交籼稻花粉活力提高了1.20个百分点，但未达显著水平；偏籼型和偏粳型杂交稻花粉活力则显著提高，但仍显著低于常温对照水平。结果表明，与籼粳杂交稻相比，高温下杂交籼稻仍具有相对较高的花粉活力，偏粳型杂交稻花粉活力受高温影响最明显；BR喷施可有效缓解高温对籼粳杂交稻花粉活力造成的损伤，其中偏粳型杂交稻恢复较明显。

图3 高温和BR处理下不同遗传背景杂交稻花粉活力(比例尺=300 μm)Fig.3 Effect of BR application on pollen vigor of hybrid rice with different genetic background under high temperature (scale=300 μm)

注：不同大写字母表示同一处理不同品种间差异显著(P<0.05)，不同小写字母表示同一类型品种在不同处理间差异显著(P<0.05)。Note:Different capital letters indicate significant difference at 0.05 level of different varieties under the same treatment.Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level of the same variety under different treatments.图4 高温和BR处理下不同遗传背景杂交稻花粉活力Fig.4 Effect of BR application on pollen vigor of hybrid rice with different genetic background under high temperature

2.3 抗氧化能力及相关基因表达

注：不同小写字母表示同一个品种不同处理间差异显著(P<0.05)。下同。Note:Different lowercase letters indicate significant difference among different treatments in same variety at 0.05 level.The same as following.图5 高温和BR处理对不同遗传背景杂交稻抗氧化能力的影响Fig.5 Effect of BR application on antioxidant capacity under high temperature.

AsA、GSH和GlyⅠ是抗氧化防御系统中重要的组成之一，均可有效降低植物体内超氧阴离子含量，在非生物应激过程中起到关键作用。由图5可知，当植物受到外界高温刺激时，所有水稻品种细胞内超氧阴离子含量升高，杂交籼稻、偏籼型和偏粳型杂交稻分别平均增加5%、6%和13%。高温下喷施BR后超氧阴离子含量与高温对照相比，分别降低了3%、8%和15%。高温处理10 d后，AsA、GSH含量和GlyⅠ活性显著低于常温对照，其中杂交籼稻AsA、GSH含量和GlyⅠ活性分别较常温对照下降6.67%、1.92%和8.29%；偏籼型杂交稻分别下降24.30%、20.91%和11.56%；偏粳型杂交稻分别下降22.92%、29.49%和24.89%。高温下喷施BR后，AsA、GSH含量和GlyⅠ活性总体显著升高，且部分品种达到或接近常温对照水平。其中，与高温且未喷施BR处理相比，杂交籼稻的AsA、GSH含量和GlyⅠ活性分别上升3.93%、13.84%和6.95%；偏籼型杂交稻分别上升9.26%、22.02%和12.81%；偏粳型杂交稻分别上升37.20%、53.04%和14.13%。综上，喷施BR能够增加非酶抗氧化剂含量和GlyⅠ活性，降低细胞内超氧阴离子含量，提高不同遗传背景杂交稻的耐高温能力；偏粳型杂交稻对高温处理表现敏感，但喷施BR后，可显著提高抗性；杂交籼稻高温下抗氧化能力较强，喷施BR对AsA、GSH含量和GlyⅠ活性也有明显的提高作用，但变化幅度明显低于籼粳杂交稻。

抗氧化系统抵御高温胁迫受相关基因调控。由图6可知，抗坏血酸过氧化物酶基因OsAPXI可负向调控AsA含量，高温处理10 d后表达水平升高，杂交籼稻提高19.91%，其上升率低于偏籼型(29.44%)和偏粳型杂交稻(28.30%)。喷施BR后，OsAPXI表达水平显著高于高温对照，杂交籼稻、偏籼型和偏粳型杂交稻的OsAPXI表达水平分别提高27.49%、32.64%和44.47%，但仍低于常温对照。乙二醛酶系统对MG系统起到了重要的解毒作用，乙二醛酶相关基因OsGLYI8在高温下表达水平显著下降，其中偏籼型杂交稻下降率最明显(27.37%)，喷施BR后OsGLYI8表达水平显著上升，且除偏粳型杂交稻外，其他品种与常温对照无显著差异。过氧化氢酶通过氧化细胞内积累的H2O2，降低ROS含量。检测过氧化氢酶相关基因OsCATB表达量，结果显示，在高温处理10 d后表达水平显著下降，杂交籼稻、偏籼型和偏粳型杂交稻分别下降11.25%、22.11%和29.84%。高温下喷施BR后，OsCATB表达水平显著上升，3种杂交稻分别上升6.26%、26.18%和38.41%，其中杂交籼稻喷施BR后与常温对照无显著差异，其他品种均显著高于常温对照。谷胱甘肽过氧化物酶基因OsGPX3可催化H2O2和其他有机过氧化物，是重要的抗氧化酶之一。高温下OsGPX3表达水平显著下降，杂交籼稻、偏籼型和偏粳型杂交稻分别下降18.05%、35.90%和35.09%；喷施BR后，OsGPX3表达水平与常温对照无显著差异。

图6 高温下喷施BR对不同遗传背景杂交稻细胞抗氧化相关基因表达量的影响Fig.6 Effect of BR application on relative expression of antioxidant genes under high temperature

3 讨论

近年来高温热害频繁发生，已经成为水稻产量，尤其是杂交稻产量的限制因素之一。经前人报道，水稻穗分化期是幼穗分化和颖花形成的关键时期，该时期高温将导致每穗粒数显著降低[26-27]。本研究结果显示，开花期高温导致每穗粒数降低，但下降幅度相对较小，其原因可能是，尽管该时期颖花已经基本完成分化，但是高温导致穗下部颖花发生不同程度退化，影响每穗粒数。Wu等[28]研究表明喷施芸苔素内酯可以增加水稻分蘖数和每穗粒数，从而提高产量。而本研究结果显示，高温下喷施BR对不同遗传背景杂交稻的分蘖数和每穗粒数影响较小，与高温对照相比并无显著差异，表明在开花期喷施0.15% BR，尽管可以在一定程度上降低颖花退化率，但效果并不显著，其原因可能是高温处理仅在水稻开花期，该时期并不是分蘖和颖花形成的关键时期。

粳稻多生长于气温较低的温带地区，具有较强的耐寒性，籼稻生长于气温相对较高的热带和亚热带地区，耐热性较强[29-30]。籼粳杂交稻品种受双亲的遗传特性影响，偏籼型杂交稻耐热性强于偏粳型杂交稻[31]。在本研究中，2个杂交籼稻的耐热系数显著高于其他籼粳杂交稻，其中偏粳型杂交稻耐热性最差，这与前人研究结果相一致。在高温下喷施BR后，偏粳型杂交稻的恢复系数显著高于偏籼型和杂交籼稻。抗氧化能力分析表明，高温处理下喷施BR能显著增加受热害损伤后的偏粳型杂交稻的抗氧化剂含量和GlyⅠ活性，但对杂交籼稻的作用效果相对较小，这可能是导致不同类型杂交稻恢复系数不同的主要原因。

刘业涛等[18]研究表明，经高温处理7 d后，水稻为抵御外界刺激，SOD、CAT、POD活性增加，而持续高温处理15 d后这些酶活性显著下降，表明抗氧化酶活性在高温胁迫后迅速升高，当植株自身抵御能力达到极限后相关酶活性开始下降。在本研究中，选取高温处理10 d后水稻剑叶，结果显示AsA等含量相对于常温对照已经呈下降趋势，而此时超氧阴离子积累量上升；喷施BR后，这些指标相对于高温对照组均呈上升趋势，而超氧阴离子含量相对较低。说明在本试验条件下，杂交稻的自我保护能力维持时间小于10 d，当体内ROS含量达到一定浓度，会对植株产生损伤，在此期间，不同类型杂交稻间抗氧化能力存在显著差异。

本研究结果表明，高温处理后水稻剑叶AsA含量下降，抗坏血酸过氧化物酶基因OsAPXI表达量上升，说明OsAPXI负调控AsA的合成。在本研究中，高温胁迫下，GSH含量下降，其相关基因OsGPX3表达量也显著下降，表明OsGPX3正向调节GSH的合成，从而调节ROS含量。GlyⅠ相关基因OsGLYI8在高温处理10 d后表达水平显著下降，且GlyⅠ活性和GSH含量降低，表明高温刺激后OsGLYI8正向调控GlyⅠ含量。植物抗氧化系统主要包含抗氧化酶和非酶抗氧化剂2种，大量研究表明抗氧化酶如SOD、CAT、GPX等，在高温胁迫后其活性发生变化[32-33]，在本研究中AsA、GHS、GlyⅠ等在高温胁迫下的变化趋势均与前人研究结果相一致，但是在不同杂交稻类型中存在差异，这些差异导致不同类型杂交稻对高温胁迫的抵抗能力不同。综上所述，高温引起水稻体内氧化负担，通过喷施BR可增强抗氧化系统和乙二醛酶系统对植株的保护能力，提高水稻开花期的耐高温性。但是BR对热害损伤的缓解效果在品种间存在差异，偏粳型杂交稻在BR喷施后其耐热系数上升幅度显著高于杂交籼稻和偏籼型杂交稻。有研究显示，BR可通过增强2-半胱氨酸过氧化物酶(2-cysteine peroxiredoxin,2-Cys)和呼吸氧化酶1 (respiratory burst oxidase homolog1,RBOH1)和GRX的信号级联反应，提高番茄在冷胁迫下的抗氧化能力[34]。但高温处理下BR是如何感知并调控细胞抗氧化能力的生理与分子机制尚不明确，且不同遗传背景的杂交稻对BR作用效果差异也有待进一步研究。

4 结论

本研究结果表明，高温处理下，杂交籼稻抗氧化能力显著高于籼粳杂交稻，但开花期喷施BR有效提高了籼粳杂交稻的抗氧化相关基因的表达量和抗氧化系统清除超氧阴离子能力，可使喷施BR后的籼粳杂交稻达到正常的生长状态。常温处理下，籼粳杂交稻产量高于杂交籼稻，而高温处理下籼粳杂交稻产量大幅下降，但偏籼型杂交稻产量仍高于偏粳型杂交稻和杂交籼稻。高温下喷施BR后，偏籼型和偏粳型籼粳杂交稻产量显著上升。因此，在高温频发的稻区，可种植偏籼型籼粳杂交稻，或者选择偏粳型籼粳杂交稻且在开花期喷施0.15% BR，可以有效缓解热害对产量造成的伤害。