长链非编码RNA小核仁RNA宿主基因7调控卵巢癌细胞迁移和侵袭的机制研究

于利，张明，王迪

卵巢癌是女性恶性肿瘤，其死亡率在妇科恶性肿瘤中排名首位［1］。研究显示，卵巢癌不仅早期发病隐匿、发展速度快，其还具有转移能力强、恶性程度高等特点，积极寻找有效手段治疗卵巢癌是目前亟待解决的问题［2］。随着分子生物学及各种实验技术的不断发展和成熟，生物靶向治疗肿瘤逐渐成为现阶段研究的热点。卵巢癌的发生与组织中基因的表达改变有关，这些基因调控着肿瘤细胞的生长和转移，是肿瘤恶性进展的关键因子。长链非编码RNA（lncRNA）是一个非编码RNA，其不具备编码蛋白质的功能，在人体内的各个组织中表达，参与调控众多生理过程［3］。lncRNA还与人类的疾病发生有关，目前已知其参与心肌损伤、肺炎、关节炎等疾病进程，lncRNA还有望成为疾病治疗的靶点［4］。在人类肿瘤中发现多种lncRNA的表达变化，这些lncRNA与肿瘤的转移相关［5］。lncRNA小核仁RNA宿主基因7（SNHG7）在人类的不同组织中的表达水平不同，其是一个肿瘤调控因子，在胰腺癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤中发现SNHG7具有促肿瘤进展的作用，下调SNHG7可以抑制肿瘤细胞的恶性生长和转移［6-8］。本研究于2019年6—12月探讨下调SNHG7对卵巢癌SK-OV-3细胞侵袭以及迁移的影响和机制，为靶向分子治疗卵巢癌提供可能。

1 材料与方法

1.1 材料卵巢癌SK-OV-3细胞购自美国ATCC；波形蛋白（Vimentin）抗体购自武汉艾美捷科技有限公司；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen；实时定量PCR试剂购自宝生物工程（大连）有限公司；引物由北京安必奇生物科技有限公司合成；上皮钙黏蛋白（E-cadherin）抗体购自美国Proteintech。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 细胞转染卵巢癌SK-OV-3细胞中分别转染SNHG7干扰表达质粒（SNHG7 shRNA）和阴性对照质粒（shRNA），将转染以后的细胞分别命名为Sh-SNHG7和Sh-NC组，常规培养的细胞为对照（Control）组。SNHG7 shRNA、shRNA阴性对照均由和元生物技术（上海）股份有限公司构建。

1.3 SNHG7表达水平测定用实时定量PCR方法测定细胞中SNHG7表达变化，步骤如下：收集培养24 h后的Control、Sh-NC、Sh-SNHG7组细胞，用Trizol试剂提取细胞总RNA，进行逆转录反应，逆转录体系为10 μL，包括：0.5 μL的核糖核酸酶抑制剂（RNase Inhibitor）、0.5 μL的dNTP混合物（dNTP mixture）、2 μL的5×PCR缓冲液、0.5 μL的寡核苷酸dT引物（Oligo dT Primer）、1 μL的RNA、5.5 μL的无RNA酶水（RNase free），逆转录条件为：37℃、15 min，85℃、5 s，4℃保存。根据以下体系进行PCR反应，包括：0.2 μL的染料（DYE）Ⅰ、3.4 μL的荧光DNA结合染料（SYBR Green）、0.2 μL的正反向引物、1 μL的cDNA、5 μL的RNase free水，PCR反应条件为：95℃30 s，95℃5 s，60℃34 s，40个循环。设置甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参，按照常规2-ΔΔCt法计算SNHG7表达量。GAPDH正向引物5，-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3，，反向引物5，-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3，；SNHG7正 向 引 物5，-CAACTGCCTGAAACCCCATCT-3，，反 向 引 物5，-CGGGTTCAAGCGATTCTCCT-3，。

1.4 细胞增殖能力测定用MTT方法测定细胞增殖能力，细胞增殖能力以A值代表，A值越大，细胞增殖能力也就越强，MTT步骤简述如下：在96孔板中按照每孔2×103个细胞将Control、Sh-NC、Sh-SNHG7组细胞分别接种，每孔中添加100 μL的细胞培养液，培养24 h，添加10 μL MTT溶液，孵育4 h后添加150 μL二甲基亚砜（DMSO），酶标仪上测定A470nm值。

1.5 细胞克隆形成能力测定用平板克隆实验检测细胞克隆形成能力，步骤简述如下：将Control、Sh-NC、Sh-SNHG7组细胞分别接种到6 cm的细胞培养皿内，每个培养皿中加200 μL的浓度为1×103个细胞∕mL的细胞悬浮液，然后添加细胞培养液至5 mL，放在培养箱中培养14 d，此时肉眼可见明显的细胞集落。将细胞培养液吸掉，加磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次细胞，以4%的多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色，干燥以后，显微镜下观察细胞克隆数目。

1.6 细胞侵袭和迁移能力测定将Control、Sh-NC、Sh-SNHG7组细胞用不含血清的细胞培养液悬浮，侵袭实验前用基质胶将Transwell小室包被，迁移实验则不加基质胶。取200 μL上述细胞悬浮液接种到Transwell上室，培养24 h，用棉签擦除没有穿膜的细胞，结晶紫染色后，在显微镜下观察计数。

1.7 细胞中Vimentin、E-cadherin蛋白表达水平测定用Western blotting方法检测Vimentin、E-cadherin蛋白表达，步骤简述如下：收集培养24 h后的Control、Sh-NC、Sh-SNHG7组细胞，将上清溶液弃掉，添加含有苯甲基磺酰氟（PMSF）的放射免疫沉淀分析裂解液（RIAP），放在冰上充分裂解，转移到离心管内，在4℃条件下以12 000g离心20 min，吸取上清，用二辛可宁酸（BCA）方法测定浓度。按照常规方法分别制备实验用分离胶以及浓缩胶，设置分离胶中电泳电压为100 V，浓缩胶中电泳电压为80 V。染料进入到分离胶的底部以后将电源关闭。取出凝胶，在4℃转膜，转膜电压设置为60 V，转膜持续40 min。转膜结束后取出聚偏二氟乙烯膜（PVDF），经过5%牛血清白蛋白封闭以后，分别与一抗、二抗依次结合后，用电化学发光液（ECL）方法显色，设置GAPDH作为内参，分析Vimentin、E-cadherin蛋白表达量。

1.8 SNHG7靶向关系预测和鉴定用starbase生物信息软件发现SNHG7和miR-34a有互补结合位点，二者可能互为靶向关系。以荧光素酶报告系统鉴定靶向关系，分别将SNHG7野生型荧光素酶报告质粒（SNHG7-WT）、突变型荧光素酶报告质粒（SNHG7-MUT）同miR-34a模拟物（miR-34a mimics）及阴性对照（mimics control）共转染到SK-OV-3细胞中，24 h后检测荧光素酶活性变化，步骤同荧光素酶活性检测试剂盒。SNHG7-WT、MUT分别为含有SNHG7的结合序列和含有突变以后的SNHG7结合序列的荧光素酶报告载体，载体由中洪博元生物集团有限公司构建。miR-34a mimics、mimics control购自上海吉玛制药技术有限公司。收集培养24 h后的Control、Sh-NC、Sh-SNHG7组细胞，用实时定量PCR方法测定细胞中miR-34a表达变化，步骤同1.3，内参为核小分子RNA（U6）。

1.9 miR-34a inhibitor对下调SNHG7影响卵巢癌细胞的作用检测卵巢癌SK-OV-3细胞中分别共转染SNHG7 shRNA+miR-34a抑制剂（miR-34a inhibitor）和SNHG7 shRNA+miR-34a抑制剂阴性对照（inhibitor control），依次命名为Sh-SNHG7+anti-miR-34a和Sh-SNHG7+anti-miR-NC组，按照1.4（MTT）、1.5（克隆形成实验）、1.6（Transwell小室）、1.7（Western blotting）中方法测定细胞增殖、克隆、侵袭迁移和Vimentin、E-cadherin蛋白表达。

1.10 统计学方法用SPSS 21.0软件分析，计量资料用±s表示，两组数据间比较经成组t检验，多组差异比较用单因素方差析，多组间两两比较采用SNK-q检验的方法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SNHG7 shRNA对卵巢癌细胞增殖、克隆、侵袭、迁移和Vimentin、E-cadherin蛋白表达影响与Sh-NC组比较，Sh-SNHG7组卵巢癌细胞中SNHG7表达水平降低，细胞增殖（A值）降低，克隆数目减少，侵袭和迁移数目减少，Vimentin蛋白表达量减少，E-cadherin蛋白表达量升高，见图1和表1。SNHG7 shRNA下调卵巢癌细胞中SNHG7表达水平，降低卵巢癌细胞增殖、克隆、迁移以及侵袭能力。

表1 SNHG7 shRNA转染后的卵巢癌细胞中SNHG7水平、增殖、克隆、侵袭、迁移和Vimentin、E-cadherin蛋白表达水平比较∕±s

表1 SNHG7 shRNA转染后的卵巢癌细胞中SNHG7水平、增殖、克隆、侵袭、迁移和Vimentin、E-cadherin蛋白表达水平比较∕±s

注：SNHG7为小核仁RNA宿主基因7，Control为对照组，Sh-NC为转染SNHG7阴性对照质粒组，Sh-SNHG7为转染SNHG7干扰表达质粒组，A值为吸光度值，Vimentin为波形蛋白，E-cadherin为上皮钙黏蛋白。①与Sh-NC比较，P＜0.05。

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图1 Western blotting检测SNHG7 shRNA转染后的卵巢癌细胞中Vimentin、E-cadherin蛋白表达

2.2 SNHG7靶向调控miR-34aSNHG7和miR-34a有碱基互补结合位点，miR-34a mimics和SNHG7-WT共转染后的卵巢癌细胞荧光素酶活性下降（0.48±0.05）比（1.00±0.11），t=12.91，P＜0.001。SNHG7靶向调控miR-34a。见图2。

图2 SNHG7和miR-34a碱基互补结合位点

2.3 下调SNHG7促进卵巢癌细胞中miR-34a表达Control、Sh-NC、Sh-SNHG7组细胞中miR-34a水平分别为（1.00±0.11）、（0.98±0.10）、（2.64±0.21）。与Sh-NC组比较，Sh-SNHG7组卵巢癌细胞中miR-34a水平升高（P＜0.05）。下调SNHG7促进卵巢癌细胞中miR-34a表达。

2.4 miR-34a inhibitor对下调SNHG7的卵巢癌细胞增殖、克隆、迁移、侵袭以及Vimentin、E-cadherin蛋白表达影响与Sh-SNHG7+anti-miR-NC组比较，Sh-SNHG7+anti-miR-34a组卵巢癌细胞中miR-34a水平降低，SK-OV-3细胞增殖能力升高，SK-OV-3细胞克隆形成数、侵袭以及迁移数增多，Vimentin蛋白表达水平升高，E-cadherin蛋白表达水平下降，见图3，表2。

表2 miR-34a inhibitor和SNHG7 shRNA共转染后卵巢癌细胞中miR-34a水平、增殖、克隆、侵袭、迁移和Vimentin、E-cadherin蛋白表达水平比较∕±s

表2 miR-34a inhibitor和SNHG7 shRNA共转染后卵巢癌细胞中miR-34a水平、增殖、克隆、侵袭、迁移和Vimentin、E-cadherin蛋白表达水平比较∕±s

注：miR-34a为微小RNA-34a，SNHG7为小核仁RNA宿主基因7，Vimentin为波形蛋白，E-cadherin为上皮钙黏蛋白，Sh-SNHG7+anti-miR-NC为共转染SNHG7 shRNA和miR-34a抑制剂阴性对照，Sh-SNHG7+anti-miR-34a为共转染SNHG7 shRNA和miR-34a抑制剂，A值为吸光度值。①与Sh-SNHG7+anti-miR-NC比较，P＜0.05。

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图3 Western blotting检测miR-34a inhibitor和SNHG7 shRNA共转染后卵巢癌细胞中Vimentin、E-cadherin水平

3 讨论

lncRNA是不能编码蛋白质的RNA分子，其长度大于200 bp，在细胞增殖、个体发育等多种生物学过程中发挥调控作用［9］。lncRNA参与肿瘤进展，可能是肿瘤分子靶向治疗的生物靶标［10］。SNHG7是在人体组织中发现的lncRNA，其在不同组织中的表达不同，并且参与人体多种肿瘤的进展，目前在膀胱癌、非小细胞肺癌等组织中发现SNHG7异常表达，SNHG7表达改变影响细胞的生长以及转移过程，SNHG7可能是肿瘤治疗的有效靶点［6，11］。本研究结果表明，下调SNHG7后的卵巢癌细胞增殖、克隆能力下降，提示下调SNHG7具有抗卵巢癌细胞生长的作用，这与上述研究结果相符合，进一步说明了SNHG7在癌症中可能发挥类似癌基因的作用。

卵巢癌转移能力极强，其细胞转移是卵巢癌患者死亡的重要原因［12］。研究显示，上皮间质转化（EMT）是肿瘤转移的重要标志，发生EMT后的转移能力大大增加［13］。Vimentin、E-cadherin表达变化是EMT能力改变的可靠指标［14］。Vimentin还可以作为一种癌基因促进肿瘤进展。E-cadherin在肿瘤中表达下调，其表达上调后可以抑制肿瘤恶性转移［15］。本研究结果显示，下调SNHG7后卵巢癌细胞侵袭以及迁移能力降低，Vimentin表达水平减少，E-cadherin表达水平升高，提示上调SNHG7抑制卵巢癌细胞的转移潜能。

lncRNA广泛参与人体生理以及病理进程，并且在不同的组织及生理过程中的作用不同。lncRNA的调控机制复杂，这也是其功能多样的重要原因［16］。lncRNA可以通过不同靶向调控机制影响细胞的生长、组织分化，目前其调控机制还未完全阐明［17］。lncRNA可以通过碱基互补的方式影响miRNA的表达，从而通过多个调控网络影响细胞生物学行为［18］。本次实验表明，SNHG7和miR-34a互为靶向关系，并且下调SNHG7可以靶向促进卵巢癌细胞中miR-34a的表达。miR-34a是一个肿瘤关系密切的miRNA，参与调控肿瘤细胞的转移过程［19］。研究显示，miR-34a在骨肉瘤、肺癌、卵巢癌等中下调表达，影响细胞的生长和转移［20-24］。本实验显示，抑制miR-34a逆转下调SNHG7对卵巢癌细胞生长和转移潜能的抑制作用，提示下调SNHG7可以靶向促进miR-34a的表达阻碍卵巢癌进展。

综上，下调SNHG7表达可以在体外阻碍卵巢癌细胞的生长和转移，作用机制与靶向促进miR-34a的表达有关。我们的实验结果为研究SNHG7在卵巢癌中的网络调控作用提供了资料，为寻找有效的卵巢癌治疗生物靶标提供可思路。