泛素降解途径蛋白、碱性成纤维细胞生长因子及凋亡抑制蛋白在前列腺癌中的表达及与临床病理特征的相关性

肖 荣,于 佳,杨元强,曾振华

前列腺癌是指发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤，好发于中老年男性[1]。由于前列腺癌起病较隐匿，生长较缓慢，因此早期常被漏诊或误诊；而一旦出现症状，常属较晚期的进展性前列腺癌[2]。近年来，随着医学分子研究的不断创新，分子生物机制在前列腺癌发生、侵袭和转移中的价值越来越受到关注。

泛素降解途径在前列腺癌的发生发展中起到重要作用[3]。多项研究表示，泛素降解途径蛋白[S期激酶相关蛋白2(Skp2)、p27kip1]在恶性肿瘤中异常表达，且与患者预后关系密切[4]。碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)能够促进间叶细胞、神经外胚层和血管内皮细胞等增殖[5]。凋亡抑制蛋白(IAPs)是一类高度保守的内源性凋亡基因家族表达产物，Survivin是其主要成员，在肿瘤基本的发展过程中扮演着重要角色[6]。本研究就泛素降解途径蛋白Skp2、p27kip1及b-FGF、Survivin在前列腺癌中的表达及与临床病理特征的相关性进行分析，旨在为临床治疗提供新靶点。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集本院病理科于2015年1月—2017年1月保存的行手术切除的前列腺癌组织72例临床资料。纳入标准：均确诊为前列腺癌；入组前未接受放疗及化疗；临床资料完整且真实。排除标准：合并血液疾病者；严重精神疾病或痴呆者；其他原发性恶性肿瘤者；合并风湿免疫及结缔组织病变者。70例均符合本研究要求，作为前列腺癌组，年龄38～78(54.37±6.71)岁。同时选取同期本院病理科保存的良性前列腺增生标本60例作为良性组，所有患者无长期药物治疗史且临床资料完整，年龄35～79(55.11±6.34)岁。2组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法 收集所有患者临床资料，包括年龄、术前前列腺特异性抗原(PSA)水平、TNM分期、组织分化程度、脉管内瘤栓情况、Gleason评分等。

1.3检测方法及结果判定

1.3.1检测方法：肿瘤组织制成石蜡块，正常组织去除皮下脂肪后固定，石蜡包埋。所有组织切片，厚4 μm，待染。用R-3G54型微波炉(800 W)煮20 min后浸泡在缓冲液中在室温下冷却20 min，再次以蒸馏水和PBS缓冲液冲洗。滴加正常山羊血清，直接在切片中加入一抗于37 ℃下静置30 min后放入4 ℃环境下过夜，次日复温冲洗浸泡后滴加二抗于30 ℃下静置20 min，冲洗浸泡后再滴加三抗，于37 ℃下静置30 min。再次冲洗浸泡后行DAB显色，于低倍光镜下控制显色反应30 min，显色反应结束后以苏木素复染核，封片。

1.3.2结果判定标准：Skp2、p27kip1阳性表达着色部位在细胞核，b-FGF、Survivin阳性表达着色部位在细胞浆，呈棕黄色或棕褐色。实验以PBS代替一抗作为阴性对照：按阳性细胞百分率评分：<25%为1分，25%～50%为2分，≥50%为3分；按染色强度评分：不着色为0分，浅棕黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分[7]。综合染色阳性细胞数与染色强度判断结果：阴性(-)0分，弱阳性(+)1～2分，中度阳性(++)3～4分，强阳性(+++)5～6分。两种计分乘积为每例的加权分数，加权分数为0为阴性，其余均为阳性。读片均由两名及以上5年工作经验的病理科医师独立观察每张切片后共同诊断。

1.4观察指标 比较2组Skp2、p27kip1、b-FGF、Survivin表达情况及与前列腺癌病理参数、预后的相关性。

1.5随访方法 本研究随访3年，截止时间为2020年1月30日或患者死亡，总生存时间为前列腺癌患者从手术至死亡的时间[8]。

2 结果

2.1前列腺癌组与良性组Skp2、p27kip1、b-FGF、Survivin表达情况 前列腺癌组p27kip1阳性表达率低于良性组，Skp2、b-FGF、Survivin阳性表达率高于良性组(P<0.01)。见表1。

表1 前列腺癌组与良性组Skp2、p27kip1、b-FGF、Survivin表达情况[例(%)]

2.2Skp2、p27kip1、b-FGF、Survivin与前列腺癌病理参数的相关性 Skp2、p27kip1、b-FGF、Survivin与前列腺癌组织分化程度、TNM分期、Gleason评分及术前PSA水平有关(P<0.01)，与年龄、脉管内瘤栓情况无关(P>0.05)。见表2～3。

表2 Skp2、p27kip1表达情况与前列腺癌病理参数的相关性(例)

表3 b-FGF、Survivin表达情况与前列腺癌病理参数的相关性 (例)

2.3生存组与死亡组Skp2、p27kip1、b-FGF、Survivin表达比较 根据患者预后情况分为生存组49例和死亡组21例。生存组p27kip1阳性表达率高于死亡组，Skp2、b-FGF、Survivin阳性表达率低于生存组(P<0.05,P<0.01)。见表4。

表4 生存组与死亡组Skp2、p27kip1、b-FGF、Survivin表达情况比较[例(%)]

2.4影响前列腺癌患者预后生存的多因素Logistic回归分析 术前PSA水平>4 μg/L、中低分化、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、Gleason评分≥7分、p27kip1阴性表达及Skp2、b-FGF、Survivin阳性表达是影响前列腺癌患者预后生存的独立危险因素(P<0.05,P<0.01)。见表5。

表5 影响前列腺癌患者预后生存的多因素Logistic回归分析

2.5Skp2、p27kip1、b-FGF、Survivin表达情况与前列腺癌患者预后生存的关系 Skp2、b-FGF、Survivin阳性表达患者生存时间短于阴性组，p27kip1阴性表达患者生存时间短于阳性组(P<0.01)。见图1～4。

图1 Skp2表达与前列腺癌患者预后生存的关系

图2 p27kip1表达与前列腺癌患者预后生存的关系

图3 b-FGF表达与前列腺癌患者预后生存的关系

图4 Survivin表达与前列腺癌患者预后生存的关系

3 讨论

前列腺癌是我国成年男性多发的恶性肿瘤，其发病率呈逐年上升趋势。临床实践发现，前列腺癌对放、化疗不敏感，采用内分泌治疗一段时间后，癌细胞由雄激素依赖性变为雄激素非依赖性，使肿瘤细胞的增殖无法控制而导致内分泌治疗失败，因此探索基因疗法显得尤为重要[8-10]。

最近研究发现，泛素化与去泛素化的改变和多种肿瘤的发生密切相关，通过调节泛素-蛋白水解酶途径可以抑制多种肿瘤细胞增殖[11-12]。最近研究表明，Skp2在乳腺癌、结肠癌、鳞癌等恶性肿瘤中表达增加，同时p27kip1蛋白水平降低，且其表达水平的异常改变也提示患者预后较差[13]。而Skp2蛋白是泛素连接酶E3结合磷酸化p27的识别蛋白质，参与p27的泛素化降解[14]。研究发现Skp2在调节正常细胞增殖中起重要作用，此外，其不仅参与p27的降解，同时也参与细胞周期抑制蛋白P21和P30降解[15]。本研究结果显示，前列腺癌患者p27kip1阳性表达率低于良性组，Skp2阳性表达率高于良性组，且Skp2阳性表达患者生存时间短于阴性组，p27kip1阴性表达患者生存时间短于阳性组。提示Skp2、p27kip1在前列腺癌的发生发展中起重要作用，可作为前列腺癌患者病情发展及预后判断的指标之一。

b-FGF是碱性成纤维细胞生长因子，在新的基因研究中发现，其作为一种促有丝分裂原，具备促进愈合、修复和生成等功能[16]，同时可刺激细胞增殖、迁移，具有促血管生成作用[17]。而新血管生成是证实肿瘤转移和侵袭必不可少的条件，故研究该因子在肿瘤中的变化规律对于早期诊断及评估预后有重要意义[18]。本研究结果显示，前列腺癌组b-FGF阳性表达率高于良性组，且与术前PSA水平、TNM分期、组织分化程度及Gleason评分有关，说明b-FGF可促进前列腺癌的侵袭和转移。

Survivin是近年研究发现的凋亡抑制蛋白家族的新成员[19]，相关研究显示，Survivin蛋白对诱导细胞凋亡的细胞色素C及参与细胞生长有抑制作用，同时还能有效阻止参与细胞分化和凋亡的含半胱氨酸蛋白酶家族活化，故分析Survivin蛋白在前列腺癌组织中的表达，对研究前列腺癌的发生、发展及诊断、治疗有重要意义[20]。本研究结果显示，前列腺癌组Survivin阳性表达率高于良性组，说明Survivin蛋白在前列腺癌的形成和发展过程中对细胞凋亡产生了巨大的抑制作用，促进了肿瘤细胞的存活。

综上所述，Skp2、b-FGF、Survivin阳性表达率及p27kip1阴性表达率在前列腺癌组织中显著升高，其异常表达与前列腺癌的侵袭与转移关系密切，可作为预测预后生存的分子标志物和肿瘤治疗的潜在靶点。本研究中尚存在一些不足之处，如纳入样本量较少，随访方式缺乏临床验证，未来可扩大样本量，加强随访真实性。