NLRP3炎性小体在多发性硬化中的作用

栾婷婷 李燕飞 贾延劼

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种中枢神经系统慢性炎性脱髓鞘及神经退行性疾病，其病因及发病机制尚不明确。MS发病受遗传和环境因素共同影响，临床表现具有异质性，以中枢神经系统白质和灰质大量脱髓鞘为主要病理特征[1]。MS在青年人中的发病率、致残率高。截至2016年，全球MS患者超200万，年死亡人数约1.9万[2]。炎性小体是存在于人体免疫细胞细胞质中的一组多聚蛋白复合体，可识别损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)和病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，从而参与固有免疫。炎性小体活化有助于清除病原体和受损细胞，但其异常激活时可导致疾病的发生[3]。炎性小体主要包括NLRP1、NLRP3、NLRC4和AIM2，其中NLRP3最为受关注。NLRP3炎性小体最早发现与家族性寒冷性荨麻疹以及Muckle-Wells综合征(荨麻疹-耳聋-淀粉样变综合征)相关[4]。近年来研究表明，NLRP3可参与MS的发病，影响疾病进展及预后，有望成为MS的生物标志物，其相关抑制剂有望成为MS治疗的有效药物。

1 NLRP3炎性小体的构成与活化

NLRP3炎性小体由受体蛋白(NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和效应蛋白(caspase-1)组成，NLRP3含有PYD、NACHT、LRR三个结构域[5]。NLRP3炎性小体可对多种刺激做出应答，如核酸、ATP、各种病原体、结晶物质(石棉、明矾和二氧化硅)等[6-7]。这些激活剂成分各异，很难直接与NLRP3炎性小体相互作用，因此大多学者更倾向于这些激活剂引发了可激活NLRP3炎性小体的共同生理变化，如K+外流、Ca2+通路、溶酶体破坏、线粒体损伤等，但具体机制仍未得到证实[8]。

静息状态下细胞质中NLRP3和白细胞介素1β(IL-1β)水平较低，不足以形成NLRP3炎性小体，所以NLRP3炎性小体的活化分为两步：启动和激活[9]。启动：当细胞受到刺激时，细胞的Toll样受体识别PAMPs和DAMPs，核因子κB(NF-κB)激活并转移到细胞核内，启动相关基因表达，产生大量NLRP3、IL-1β前体及IL-18前体[10]。激活：在激活剂的作用下，细胞质中大量NLRP3、ASC与caspase-1聚集成蛋白复合物并相互作用，使caspase-1前体(pro-caspase-1)自我切割成有活性的caspase-1，随后活化的caspase-1将IL-1β前体和IL-18前体裂解为成熟的IL-1β和IL-18，通过激活Gasdermin D(GSDMD)，释放炎性因子，最终导致细胞焦亡[9-11]。

2 NLRP3炎性小体在MS中的作用

2.1 与MS遗传易感性的关系约15%的MS病例具有遗传倾向，但目前仅发现个别基因突变(如NR1H3[12])可能与MS的发病相关联。2009年，Compeyrot-Lacassagne等[13]发现1例Muckle-Wells综合征患者脑MRI检查结果存在类似MS的影像学病变，基因分析显示该患者体内NLRP3的NACHT结构域发生CIAS1基因突变。在此之前Lequerré等[14]亦发现类似的病例。提示MS的发病可能与NLRP3炎性小体基因突变有关。Vidmar等[15]采用二代测序(NGS)技术对319名受试者进行完整的外显子测序，发现MS患者的炎性小体相关基因位点(NLRP3、NLRP1和caspase-1)的罕见突变负荷增加。这也进一步提示了NLRP3炎性小体基因突变在MS病因中起到一定作用，为MS的病因学研究提供了新的证据。

2.2 在MS发病机制中的作用MS是一类自身免疫性疾病，Th1和Th17细胞在其发病过程中必不可少[16]。Gris等[17]通过髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型证实，Th1和Th17细胞在体内的发育需要适当的NLRP3表达，NLRP3-/-小鼠表现出MOG特异性的Th1及Th17细胞应答降低。研究表明，在EAE模型中，NLRP3炎性小体的激活产物IL-1β和IL-18可上调CD4+T细胞相关趋化因子受体(骨桥蛋白、CCR2、CCL8及CXCR6等)的表达，促进Th1和Th17细胞迁移至中枢神经系统[18]。其中IL-1β可以与MyD88衔接蛋白相互作用，诱导T细胞粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)的表达，而GM-CSF可通过促进中枢神经系统髓系细胞和小胶质细胞的激活而加重神经炎症[19]。IL-18可促进CD4+T细胞IL-17的分泌，抑制IL-10的产生[20]，在MS患者的血清及脑脊液中可检测到高水平的IL-18[21]。此外，NLRP3还可激活GSDMD导致细胞焦亡，在EAE小鼠脊髓中可观察到炎性小体的激活以及发生焦亡的小胶质细胞和少突胶质细胞，这些细胞呈GSDMD和caspase-1双阳性[11]。临床研究亦发现，复发缓解型MS(relapsing-remitting MS，RRMS)患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中炎性小体相关基因表达(如NLRP3、caspase-1及IL-1β基因)高于健康对照组，而IL-18基因未见统计学差异[22]。总之，上述研究表明IL-1β和IL-18作为NLRP3炎性小体的效应分子参与了MS的发病机制。但亦有研究结果与之矛盾，如Peelen等[22]在MS患者血浆中并未检测到IL-1β，随后通过体外培养PBMC并诱导炎性小体激活，并未发现IL-1β的分泌在MS患者和健康对照者存在统计学差异，这可能是由于NLRP3炎性小体在中枢神经系统中存在局限性激活导致。

2.3 在MS疾病进展及临床检测中的作用Gris等[17]研究发现，EAE小鼠发病期内脊髓NLRP3表达增加，NLRP3-/-小鼠髓鞘破坏、炎性浸润及胶质增生减少，整体上表现为病程延迟和疾病严重程度下降，提示NLRP3炎性小体在MS疾病进展中发挥重要作用。Malhotra等在原发进展型MS(PPMS)患者脑组织髓系细胞上检测到NLRP3和IL-1β表达，且与PBMC中NLRP3及IL-1β的mRNA表达上调相一致，提示IL-1β的上调与NLRP3炎性小体的高度活化相关，进一步证实MS存在NLRP3炎性小体的激活；此外，该研究还发现活动/非活动混合脱髓鞘损伤中NLRP3和IL-1β阳性细胞比例明显高于脱髓鞘后损伤以及对照组脑组织，表明NLRP3和IL-1β的表达与PPMS活动性病变有关，可用于判断MS是否处于活动期，但具体检测方式及有效性有待进一步研究[23]。Keane等[24]发现，与健康对照组比较，MS患者血清caspase-1、ASC和IL-18的蛋白水平升高，ASC及caspase-1诊断MS的ROC曲线下面积分别为0.94和0.85，中度MS患者血清ASC蛋白水平高于轻度患者，ASC临界点为537.5 pg/mL时其诊断的灵敏度为75%，特异度为62%，表明ASC和caspase-1是具有诊断MS潜力的血清生物标志物，其检测操作方便，可用于指导MS的诊断及治疗，其中ASC还可用于评价MS的严重程度。

2.4 作为MS治疗的靶点疾病修饰治疗(disease-modifying treatment，DMT)在MS治疗中具有重要作用，能够有效延缓疾病进展[25]。干扰素(IFN-β)是临床常用的一线DMT药物，但用于治疗RRMS时仅使患者年复发率降低32%～34%[1]。研究表明MS患者对IFN-β的应答与否与NLRP3炎性小体有关[26]。Inoue等发现，IFN-β仅对NLRP3依赖性的EAE有效，对ASC-/-和NLRP3-/-的EAE小鼠治疗效果不佳；此外，作者通过EAE模型亦证实，在体内IFN-β与单核-巨噬细胞系统中的Ⅰ型干扰素受体(IFNAR)结合，通过细胞因子信号转导抑制因子1(SOCS1)抑制Rac1的活化和线粒体活性氧的产生，进而抑制NLRP3的激活[27]。随后，Noroozi等[28]临床试验研究证实了这一观点。Noroozi等研究纳入30例MS患者，患者均对IFN-β1a治疗有反应，且患者NLRP3基因表达及血浆IL-1β水平较治疗前明显下降。上述研究提示，NLRP3炎性小体是治疗MS的一个关键靶点，开发其靶向抑制剂对治疗MS具有重要意义。目前研究较多的是MCC950，一种二芳基磺酰脲类化合物，在纳摩尔浓度下可特异、有效地阻断NLRP3的激活，抑制NLRP3诱导的ASC聚集，减少IL-1β的产生[29]。动物实验已证实MCC950具有体内活性并可有效改善EAE的严重程度[29]，是很有前景的MS治疗药物。其他一、二线DMT药物如特立氟胺、芬戈莫德、富马酸二甲酯等与NLRP3之间的关系尚未见报道。

2.5 预测MS的预后MS致残率高，多数MS患者预后较差，NLRP3炎性小体的激活是其中很重要的一个因素。Soares等[30]通过对MS患者PBMC中的5个炎性小体(NLRP1、NLRP3、NLRC4、IL-1β、IL-18)基因的8个单核苷酸多态性(SNPs)进行评估，发现NLRP3 rs35829419 C>A和IL-1β rs16944 C>T多态性在重度MS患者中的频率高于轻度患者，在疾病快速进展的MS患者中其频率高于缓慢进展患者，其中NLRP3 rs35829419 C>A与MS严重程度明显相关，表明NLRP3炎性小体激活增加是MS程度加重及预后不良的危险因素。Malhotra等研究亦发现，PBMC中IL-1β高表达的PPMS患者疾病进展更快，在7年内扩展残疾状态量表评分达6.0分，而IL-1β低水平的患者需要18年[23]。上述研究不仅表明NLRP3炎性小体的激活可使MS患者预后更差，而且提示了NLRP3炎性小体作为MS生物标志物及治疗靶点的重要性和必要性。

2.6 基于NLRP3炎性小体表达的MS分型基于NLRP3炎性小体可作为MS的生物标志物的结论，可将MS分为NLRP3炎性小体依赖型和非依赖型两类。其中NLRP3非依赖性的MS患者对临床常用的治疗方案反应可能较差。Inoue等[31]采用高剂量的热灭活分枝杆菌(Mtb)诱导出NLRP3非依赖性的EAE模型，并称之为B型EAE，这种小鼠体内NLRP3激活水平较低，血清IL-1β水平明显降低，在中枢神经系统细胞密度、脱髓鞘状态及CD4+T细胞基因表达等方面均不同于A型EAE；此外，该研究在B型EAE模型中还检测到高水平的内源性IFN-β，可抑制NLRP3的活性，并得出急性病毒感染可使A型EAE转化为B型的结论。因此，针对B型EAE，需寻找新的治疗靶点。Inoue等[31]研究还发现，在B型EAE中趋化因子受体CXCR2和淋巴毒素-β受体(LTβR)的表达增加，阻断该受体可有效改善EAE的严重程度，进而推测在IFN-β耐药的RRMS患者中，这两种受体的表达也升高。上述研究结果不仅再次证实了MS具有异质性，而且也表明了依据NLRP3表达水平对MS患者进行分型在治疗方案的选择中有重要指导意义，针对NLRP3炎性小体非依赖型MS进行深入研究将为临床MS的治疗提供了新的思路和方向。

综上所述，NLRP3炎性小体参与了MS的发生发展，是MS非常有前景的生物标志物，可用于指导MS的临床诊断、治疗及预后评价。目前，关于NLRP3炎性小体与MS的研究仍存在很大限制，其中脑组织活体标本的获取困难是主要原因，因此建立MS标本库以及开发更多MS动物模型很有必要；此外，虽然IL-1β及IL-18作为NLRP3炎性小体的效应分子参与MS的发病已成为共识，但由于具体机制尚不明确，其作为MS标志物的可行性有待进一步研究。MS是一种异质性疾病，因此将NLRP3炎性小体作为治疗靶点以及开发新的生物标志物将是未来的研究重点。