缝隙连接蛋白43在糖尿病视网膜病变中的作用

石瑶瑶 崔玉双 高宏程 陈晨

[1.山东第一医科大学(山东省医学科学院)研究生院 济南 250117；2.临沂市人民医院眼科 临沂 276000；3.潍坊医学院临床医学院 潍坊 261000]

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)的发生机制十分复杂，一直以来都是研究热点。DR通常被认为是视网膜的微血管病变，它涉及血管壁的变化、毛细血管阻塞，从而导致视网膜渗漏、缺血、视网膜细胞凋亡、炎症和新生血管形成。缝隙连接蛋白(connexin，Cx)广泛存在于视网膜细胞中，2个相邻细胞通过Cx形成缝隙连接通道，允许细胞之间直接信号交流，对维持细胞正常的生理功能意义重大。Cx43通道特性的破坏被认为是视网膜疾病病理生理学的一部分[1]。有研究发现，包括视网膜疾病在内，大多数易受Cx43介导损伤的疾病，有2个共同的病理特征：慢性炎症和血管破裂。然而，目前还不清楚通过Cx43通道介导的细胞间通讯和细胞间微环境的改变是如何与DR的发展联系在一起的。现将近年来有关Cx43在DR发病机制的研究进展综述如下。

1 Cx和缝隙连接通道

Cx是一个多基因蛋白质家族，相对分子质量为26～70 kDa。已在哺乳动物中鉴定出各种缝隙连接蛋白基因，这些基因分为2个主要谱系：i类或β类(例如Cx 26、30、31、31.1和32)；和ii类 或α组(例 如Cx 33、37、40、43和46)。人类基因组中有21种不同的连接蛋白同种型，每种Cx都是根据其分子量命名的。6个Cx亚单位寡聚成六聚体，称为半通道或连接子。1个完整的缝隙连接通道由2个相邻细胞的半通道对接产生，允许细胞之间直接信号交流，称为细胞间缝隙连接通讯(gap junction intercellular communication，GJIC)。缝隙连接以“斑块”的形式存在，在几个到几千个单独的缝隙连接通道之间形成聚集体。形成半通道的连接蛋白可以是相同或不同类型的亚基。此外，对接在一起形成缝隙连接的2个半通道可以是相同或不同类型的六聚体。

缝隙连接通道可透过直径约1 kDa 或1.5 nm的分子，并允许离子、代谢物和信号分子的快速交换。这些通道可以通过各种生理刺激和实验干预来打开和关闭。几个连接蛋白基因的靶向敲除模型也被用来证明这些通道对正常细胞生理学的功能意义。研究[1]表明，缝隙连接对许多细胞过程都很重要，包括细胞间的电耦合，并且能够在多个细胞间传达协同反应信号。在不同的连接蛋白同种类型中，Cx43在人体中最常见。它由包括星形胶质细胞、血管内皮细胞和心脏细胞在内的不同细胞类型表达，并与影响不同器官系统的疾病有关。Cx43缝隙连接通道已被证明在炎症、细胞迁移和组织收缩中发挥作用[2]。

2 高糖环境下对视网膜细胞中Cx43表达及其介导GJIC的影响

2.1 高糖下视网膜内皮细胞和周细胞中Cx43的表达 高糖(high glucose，HG)条件可显著降低Cx43的表达和GJIC活性，同时降低视网膜内皮细胞中闭锁连接蛋白-1(zonula occludens-1，ZO-1)和闭合蛋白(OCCLUDIN)的表达[3]。此外，在正常葡萄糖浓度培养基中生长的细胞中使用siRNA下调Cx43表达，降低ZO-1和OCCLUDIN表达，并增加细胞单层通透性。重要的是，当在HG条件下生长的细胞用Cx43质粒转染时，可以消除HG诱导的Cx43下调，并将Cx43表达提高到接近正常水平，观察到细胞单层通透性显著降低。当周细胞和内皮细胞共同培养时，与在正常葡萄糖浓度培养基中生长的斑块相比，在HG条件下Cx43斑块的数量减少。此外，视网膜周细胞中Cx43水平降低显示出GJIC活性降低。Huang等[4]发现糖尿病大鼠房水和HG处理的视网膜母细胞培养基中的ADMA水平升高，通过增加周细胞的通透性和凋亡、Cx43的下调和GJIC的抑制而导致DR中血视网膜屏障(blood retinal barrier，BRB)的破坏。Cx43下调可能通过损害紧密连接蛋白的表达来促进血管通透性的发展。连接蛋白这种非传统功能的异常行为独立于GJIC，可能会导致DR中视网膜血管的通透性增加。这些结果表明HG条件下调Cx43表达，并损害周细胞和内皮细胞中的GJIC活性在DR中发挥作用。

2.2 HG下视网膜müller细胞和星形胶质细胞中Cx43的表达 在HG培养条件下，müller细胞的单一培养物以及müller细胞和周细胞的共培养物中GJIC活性均显著降低[5]。这些结果提供了müller细胞之间以及müller细胞和周细胞之间的沟通在HG条件下受到损害的证据。此外，GJIC活性降低促进了这些细胞的凋亡，类似于以前关于视网膜血管细胞的报道。因此，HG诱导的视网膜müller细胞中Cx43异常下调可能促进DR相关的神经、血管稳态的破坏。

Cx43在星形胶质细胞中表达，将过量的细胞外K+通过细胞质重新分配到由缝隙连接的边缘星形胶质细胞网络中，有助于维持局部稳态。HG和糖尿病至少部分通过下调Cx43的表达来削弱脑星形胶质细胞的GJIC[6]。这表明，糖尿病介导的Cx43通道下调损害了星形胶质细胞之间缝隙连接的形成，阻碍了细胞间的交流，从而抑制了细胞存活，最终导致糖尿病早期可见的星形胶质细胞丢失。此外，研究[7]表明，星形胶质细胞可能在早期DR血管系统和视网膜内部功能障碍的变化中起着关键的作用。

2.3 HG下视网膜色素上皮细胞中Cx43的表达 视网膜血管内皮形成内部BRB，视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞形成外部BRB。在慢性高血糖应激中，RPE细胞可能经历缓慢和渐进的降解，导致外部BRB受损和中枢视力丧失。RPE细胞顶端的紧密连接在调节屏障中十分重要。然而，糖尿病损害了RPE细胞中紧密连接的超微结构完整性，导致血管过度渗漏。有趣的是，大多数缝隙连接位于RPE细胞的紧密连接中，这表明缝隙连接与紧密连接的相互作用在RPE中可能很重要。HG显著降低了大鼠RPE细胞中总细胞Cx43水平，并损害了GJIC活性。有趣的是，一种叫作反式白藜芦醇的化合物被发现可以保护RPE细胞免受HG诱导的炎症、Cx43下调和GJIC降解[8]。因此，靶向阻止RPE细胞中Cx43下调可能对维持视网膜稳态和调节外BRB具有治疗价值。

2.4 血管内皮生长因子激活Cx43的磷酸化 Cx的生物合成是一个复杂过程，涉及特定Cx基因的转录、运输、组装以及缝隙连接从细胞表面的形成和去除。Cx43特定位点的磷酸化可能在Cx43通道内化和降解中起调节作用，从而影响GJIC。此外，连接蛋白磷酸化的作用可能因细胞类型、细胞周期阶段、细胞外基质相互作用和其他功能而异[9]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是已知在DR中驱动血管通透性的主要血管生成细胞因子，也参与改变连接复合体，如缝隙连接或紧密连接。几种视网膜细胞类型，包括内皮细胞、周细胞和RPE细胞，在缺氧时释放VEGF，导致血管生成和血管通透性增高。有趣的是，VEGF通过激活内皮细胞中的促分裂素原活化激酶磷酸化Cx43来破坏GJIC[10]。具体来说，糖尿病引起的VEGF升高可导致蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的活化，PKC随后可增加Cx43、ZO-1和OCCLUDIN的磷酸化。ZO-1和OCCLUDIN磷酸化的增加可以促进血管通透性，而磷酸化的Cx43可以使GJIC降低，最终导致细胞凋亡。

3 Cx43半通道与DR

3.1 Cx半通道 Cx半通道已被证明与缝隙连接功能无关的特定作用，这些半通道介导细胞内和细胞外微环境之间分子的通过。与GJIC相比，连接蛋白半通道在“静止”条件下对细胞中的小分子(＜1 kDa ) (例如ATP、NAD+、前列腺素和小荧光染料)和离子显示出非常低的打开概率和(或)低的膜渗透性。然而，这些通道的激活或开放涉及自分泌/旁分泌信号，这提供了ATP、谷氨酸释放的途径。NAD+和前列腺素可介导细胞信号和功能的各个方面。半通道活性通过连接蛋白亚基的翻译后修饰来调节，例如S-亚硝基化、磷酸化和去磷酸化；膜物理化学条件，例如膜电压、pH值、机械刺激和单价和二价阳离子的浓度；通过细胞外信号分子，例如ATP和亲脂性分子来调节[11-12]。尽管在正常生理条件下，连接蛋白半通道的开放概率很低，但在某些刺激条件下，包括组织损伤、炎症和病理条件下，例如在缺血或缺氧应激下，半通道打开，形成病理膜孔[13]，半通道被过度激活。半通道的异常活动与继发性组织损伤有关，包括水肿、血管完整性受损和神经元死亡[1]。因此，病理状态下过度激活连接蛋白半通道主要导致正常稳态和细胞功能的破坏。

3.2 视网膜缺血再灌模型中Cx43半通道的异常开放 视网膜缺血是DR的一个重要病理特征，导致血管完整性的丧失。视网膜缺血再灌注被认为是研究动物DR的主要模型之一。在体外模拟缺氧、缺糖、缺血过程中，研究Cx43半通道在缺血再灌注损伤中的作用。Kerr等[14]研究表明，Wistar大鼠单侧视网膜缺血性损伤显著增加了缺血性和对侧视网膜的视网膜星形胶质细胞、müller细胞和血管内皮细胞中Cx43的表达，但损伤的假对照中没有。Danesh-Meyer等[1]解释说，随着Cx43的增加，细胞表面半通道募集增加，导致质膜中未连接的半通道增加，这可能与细胞内外环境之间的旁分泌和自分泌信号有关。在视网膜中细胞损伤期间，视网膜星形胶质细胞中Cx43表达的增加与细胞间钙波和死亡信号的增加相关[1]。钙信号已被证明参与局部血流调节和细胞因子释放的诱导，这导致BRB分解。血管内皮细胞Cx43的增加也已被证明通过半通道介导的内皮细胞破裂直接影响BRB功能，导致体内血管渗漏[1]，这与其他炎症损伤和典型的血管完整性丧失疾病一致。在眼压升高以诱导视网膜缺血的体内研究中，损伤后1 h就观察到内皮细胞中Cx43表达升高，并且在再灌注后4 h观察到明显的血管回流和渗漏[15]。这些变化也与胶质增生有关，其特征是星形胶质细胞的胶质纤维酸性蛋白表达增加。因此，Cx43半通道上调似乎是缺血的早期过程，可能引发血管渗漏的炎症机制，并在慢性炎症条件下持续存在。

在体外内皮细胞培养中，缺氧后再灌注导致内皮细胞死亡，应用Cx43半通道阻滞剂可防止内皮细胞死亡[16]。应用Cx43模拟肽，即阻断半通道的肽5，可减少缺血再灌注损伤引起的血管渗漏，提高星形胶质细胞的存活率[15]。由于天然肽稳定性差、递送困难，为了增强天然肽在体内的稳定性，肽5被化学修饰成C12-C12-肽5，用这种修饰的肽治疗可以减少血管渗漏、炎症，并保护缺血损伤后的视网膜神经节细胞[17-18]。最近有研究[19]发现，在缺氧诱导视网膜病变小鼠模型中，星形胶质细胞Cx43的条件性缺失维持了缺氧视网膜中星形胶质细胞的较高密度，并促进了血管恢复。因此，Cx43半通道开放与缺血中发生的血管内皮细胞的损失有关[16]。

3.3 DR中炎症与Cx43半通道的异常开放 Mugisho等[20]最近发现，DR的临床症状仅出现在玻璃体内注射促炎细胞因子的糖尿病小鼠中，而注射盐水的糖尿病小鼠没有血管损伤的迹象。此外，他们将糖尿病性Akita小鼠和晚期DR的Akimba小鼠的Cx43表达与人类DR患者供体视网膜进行了比较，发现与健康对照组相比，在确诊为DR的人供体视网膜中Cx43的表达显著增加。仅当高血糖和炎症过程相结合时，在人体组织中观察到的Cx43表达模式与体外RPE细胞数据以及体内Akimba小鼠结果相关。有趣的是，在无炎症的Akita小鼠中Cx43的表达呈现降低的趋势，这可能支持其他研究结果，这些结果报告了仅使用HG模型而不是具有炎症成分的DR中Cx43病理学的降低。此外，在确诊为DR的Akimba小鼠和人类供体视网膜中，Cx43表达的增加与血管渗漏和受损相关，这表明Cx43可能在疾病中出现的血管破裂发挥关键作用[21]。

3.4 Cx43半通道阻断剂在DR治疗中的前景 体外细胞培养研究表明，阻断Cx43半通道可通过阻断激活NLRP3炎症体所必需的自分泌三磷酸腺苷反馈环，有效地减少炎症[22]。此外，阻断NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor pyrin domain containing 3，NLRP3)炎 症 体 可 阻 止VEGF的释放，这表明Cx43半通道阻断剂可在当前抗VEGF治疗的上游发挥作用。这些发现得到了最近其他体内研究的支持，其中发现Akimba小鼠的NLRP3炎症体蛋白升高，但Akita和野生型小鼠没有升高[23]。炎症过程中，核因子κβ(nuclear factor-kappa β,NF-κβ)通路的激活导致炎症细胞因子前体的产生。为了将这些细胞因子从它们的前体形式转化为活性形式，前半胱天冬酶1必须被切割成活性半胱天冬酶1，这发生在NLRP3聚集(炎症体复合装配)期间。因此，NF-κβ与受Cx43半通道阻滞调控的NLRP3通路有直接关系。因此，抑制Cx43半通道有可能在疾病过程早期干预，首先预防炎症，然后在慢性疾病中打破NLRP3炎症体途径中的自我延续反馈回路，这是DR的一个关键特征[22-24]。这些阻断剂在视网膜疾病(如视网膜缺血[15]、年龄相关性黄斑变性[25]、DR[26])的啮齿类动物模型中能够有效减少炎症和血管渗漏。Cx43半通道阻断剂能够阻断促炎细胞因子释放和血管完整性丧失引起的免疫系统激活[22]。以这种方式，Cx43半通道阻断剂在抗VEGF药物的上游起作用，先减少炎症体的活化和炎症，有可能防止新血管形成，最终防止糖尿病黄斑水肿(diabetic macular edema，DME)的发生。

4 讨论

临床上DR分为非增生型糖尿病视网膜病变(nonproliferative diabetic retinopathy，NPDR)和增生型糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，PDR)。糖尿病早期可能主要是由于高糖引起视网膜内皮细胞、周细胞、müller细胞、星形胶质细胞和RPE细胞中Cx43的表达下降，从而影响其介导的GJIC活性，GJIC活性降低可能造成毛细血管基底膜增厚、血管渗漏、视网膜细胞凋亡和炎症。

DR早期血流变化可导致视网膜血管系统的慢性炎症，从而导致进行性不可逆缺血、缺氧的发展，引起特征性微血管变化。氧化应激以及炎症都会使机体产生VEGF，VEGF升高可导致PKC的活化，PKC的活化可增加Cx43、ZO-1和OCCLUDIN的磷酸化，从而促进血管通透性增加，进一步导致细胞凋亡。

随着DR病情的发展，正常的Cx43及其Cx通道表达继续下降，此时机体可能代偿增加Cx43的合成。随着Cx43的表达及其导致的细胞表面半通道募集，引起质膜中未连接的半通道增加，这可能与细胞内外环境间的旁分泌和自分泌信号有关。

DME是NPDR视力丧失的最主要原因。组织损伤、炎症和缺血、缺氧应激下Cx43半通道异常表达增加，进一步激活NLRP3炎症体所必需的自分泌三磷酸腺苷反馈环，加重炎症并促进VEGF的释放，视网膜血管通透性进一步增加，从而导致DME的发生。

DR早期症状不易察觉，当病情进一步发展进入PDR，新生血管形成、视网膜前纤维血管膜增生及牵拉性视网膜脱离，导致不可逆的视力丧失。因此，探究DR的发生机制和早期防治意义重大。研究Cx43在DR的发病机制中的作用，旨在探讨预防、控制DR发生及发展，寻求降低该病致盲率的有效途径。