细菌抗噬菌体感染主动免疫机制的研究进展

朱 丹，王 英，文 豪，邢 坤，林思杨

（四川省动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041）

1 概述

噬菌体（Phage）作为病毒的一种，可特异性“捕食”细菌。根据噬菌体是否导致细菌死亡，可分为温和性噬菌体和烈性噬菌体。噬菌体作为抗生素的替代品之一，具有制备工艺简单、高特异性和不受细菌耐药性影响等优点［1］。目前噬菌体已广泛应用于畜禽养殖中，特别是在家禽养殖中用于预防和控制大肠杆菌、沙门氏菌和空肠弯曲杆菌等细菌感染。但细菌会针对噬菌体的感染进化出自我防御机制，自我防御机制可以分为两大类，分别为被动免疫及主动免疫。被动免疫主要是通过细菌的荚膜、生物膜等外部结构或者次级代谢产物来抵御噬菌体的侵蚀，而主动免疫机制较为复杂，本文就细菌抗噬菌体感染的主动免疫机制进行介绍，为今后开发和应用噬菌体制剂提供理论参考。

2 主动免疫机制

2.1 阻止噬菌体吸附 在噬菌体侵染过程中，噬菌体的受体结合蛋白通过特异性识别细菌的脂多糖、荚膜多糖以及外膜蛋白等受体完成吸附，而细菌通过改变表面受体的结构或构象等方式，有效限制噬菌体的吸附。如鼠疫耶尔森菌的合成脂多糖相关基因会自发突变，导致该菌产生对多种噬菌体的抗性。还有一些细菌可利用产生的“栅栏”来干扰噬菌体对受体的辨别，如大肠杆菌K1的荚膜能有效阻止噬菌体T7 吸附脂多糖。此外，细菌还能通过结合外环境中的小分子封闭噬菌体结合位点来阻止噬菌体吸附。

2.2 抑制噬菌体DNA 侵入 超感染排除系统（Sie）是细菌防止噬菌体DNA 入侵菌体的“首道屏障”。以大肠杆菌的Sie系统为例，Sie系统是由Imm 和Sp 蛋白的Imm 系统和Sp 系统组成。Imm系统和Sp 系统能阻止DNA 侵入细菌，防止噬菌体的进一步感染。其中，Imm 系统中两个位于细胞膜的特殊跨膜区域可在噬菌体DNA 侵入时发生构象改变，但Imm系统须在其他膜蛋白的协同作用下发挥对噬菌体的抑制作用。噬菌体T4 溶菌酶通过降解细胞壁肽聚糖形成空洞，让噬菌体DNA 侵入细菌［2］，而Sp 蛋白可通过抑制T4 溶菌酶的活性来防止肽聚糖层的降解。

2.3 阻断或干扰噬菌体DNA复制

2.3.1 限制-修饰系统 限制-修饰系统（RM）存在于75%的原核生物基因组中，许多DNA甲基化转移酶是一些限制性-修饰基因系统的成分［3］。RM 系统可阻止噬菌体DNA 进入，从而使细菌能够抵抗噬菌体感染。此功能主要取决于噬菌体是否含有RM 系统基因编码产物的识别序列，与噬菌体的类别没有绝对的联系。EcoRII 甲基转移酶（M.EcoRII）属于Ⅱ型限制-修饰系统，可以对DNA序列甲基化，并抑制EcoRII核酸内切酶对该DNA 序列进行切割。当EcoRII RM 基因复合体受到扰乱以后，其甲基化转移酶不能发挥正常的修饰作用，从而导致限制酶对自身DNA 序列酶切，最终基因组被破坏，导致细菌死亡。

天蓝色链霉菌中还存在另外一种RM 系统，噬菌体生长限制（Pgl）系统。该系统主要针对类似φC31 噬菌体等温和性噬菌体，由DNA 甲基转移酶PglX、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PglW、ATPase酶PglY、碱性磷酸酶家族PglZ 4 种蛋白组成［4］。在未被噬菌体感染的细菌中，PglX与PglZ类似于毒素/抗毒素系统，PglZ 能够抑制PglX 的活性［5］。Pgl＋链霉菌被噬菌体φC31 感染时，PglW 通过磷酸化作用将信号传递给其他Pgl 蛋白，激活PglX DNA甲基化酶作用［6］。

2.3.2 CRISPR-Cas 系统 细菌CRISPR-Cas 系统由具有典型间隔短回文重复单元（CRISPR）和分布在操纵子区域的多种Cas 基因组成。CRISPR 单元主要位于细菌染色质上，由富含AT的前导序列（Leader sequence）、高度保守的重复序列（repeats，21-48 bp）和间隔序列（Spacer）组成。在CRISPR 位点附近，存在4～10 个保守的CRISPR 相 关（CRISPR-associated，Cas）基 因。CRISPR-Cas 系统作为细菌特有的主动免疫系统，可特异性抵抗外源基因的入侵［7］。CRISPRCas 系统作为细菌的主动免疫系统，不但具有可遗传性，还具有与真核免疫细胞类似的特异性和记忆性。

2.3.3 BREX 系统 噬菌体排除系统（BREX）首次发现于蜡样芽孢杆菌中，约10%细菌基因中具有该系统，该系统位于基因组的防御岛上。BREX 系统一般在噬菌体感染后期发挥作用，具有与Pgl系统中相同的同源物——甲基化酶PglX和碱性磷酸酶PglZ。与Pgl系统不同，BREX系统通过m6A DNA腺嘌呤甲基化酶使细菌基因组中的非回文TAGGAG 序列甲基化，而噬菌体DNA不会甲基化［8］。BREX系统仅抑制噬菌体DNA复制和繁殖，不会降解噬菌体DNA。

2.3.4 DISARM 系统 DISARM 系统是一种新型抗噬菌体防御系统，它能预防来自有尾双链DNA噬菌体的感染。构成DISARM系统的核心基因是解旋酶基因（drmA）、DUF1998（pfam0939）结构域基因（drmB）和PLD（磷脂酶D）结构域编码基因（drmC）。DISARM 系统分为I 型和II 型。除3 个核心基因外，I 型包括2 个基因，分别为腺嘌呤甲基化酶基因（drmMI）、SNF2 家族解旋酶基因（drmD）；而II 型也包含2 个基因，分别为胞嘧啶甲基化酶基因（drmII）、某个功能未知的基因。Ofir 等［9］在不含II 型DISARM 系统的枯草芽孢杆菌中导入该系统后，发现导入该系统的枯草芽孢杆菌具备了抗多种双链DNA 噬菌体的能力。进一步研究发现，该系统不仅能限制性切割噬菌体DNA，还可以甲基化修饰细菌DNA 的CCWGG（W＝A/T）序列。

2.4 流产感染机制 流产感染（Abi），也被叫做噬菌体排斥，一般发生在噬菌体DNA侵入细菌之后，细菌通过自身死亡的方式阻止噬菌体的进一步繁殖与释放。毒素-抗毒素机制是一种典型的流产感染机制，毒素-抗毒素系统（TA）位于质粒、整合性结合元件、转座子等可移动遗传元件上。按照抗毒素的生化特征，TA 主要分为两种：I 型TA 系统抗毒素是小RNA，可以干扰毒素基因的表达［10］；II型TA系统抗毒素是小的且稳定性较差的蛋白质，可以与毒素蛋白形成复合体，使毒素蛋白处于非活性状态。该系统与大量的细胞功能有关，包括程序化细胞死亡、可移动遗传元件、抗生素耐药性等［11］。细菌具有多种TA 系统，但不同菌株分布的种类有很大差异，可能是通过水平转移方式进行转移。其之所以可以进化成功，很可能是因为质粒编码TA 系统具有“分离后致死效应”［12］。近几十年来，随着TA 位点越来越多的发现，调控细菌生存和适应的策略将被揭示。

除了TA系统外，研究还发现环状GMP-AMP合酶（cGAS）防御系统也属于流产感染机制的一种。cGAS-STING途径是动物细胞自主先天免疫系统的核心组成部分。cGAS 蛋白是细胞质病毒DNA 的传感器，在检测到DNA 时，产生环状GMP-AMP 信号分子，该分子结合STING 蛋白并激活免疫应答［13］。

3 展望和分析

在细菌免疫系统中，不同免疫机制相互协调，共同维持细菌稳态。RM 系统、CRISPR-Cas系统、BREX 系统、DISARM 系统构成了防御噬菌体感染的胞内第一道防线，限制了噬菌体DNA和质粒等移动遗传元件的有效性，阻止噬菌体的繁殖，保护单个细菌不被感染。若噬菌体突破了宿主防御的第一道防线，细菌也可通过Abi 系统诱发死亡，中断噬菌体繁殖过程，限制噬菌体扩散，以“牺牲小我”的形式保护群体不被灭绝。除了上述机制之外，在细菌的防御岛上还发现多个抗噬菌体系统相关基因，但其具体的作用机制仍然不清楚。细菌利用不同免疫机制抵御噬菌体感染，一旦了解细菌免疫噬菌体的机制，临床上就可以通过人工改造或修饰噬菌体的关键分子或蛋白，达到免疫逃逸的目的，有助于噬菌体制剂的开发和应用。