UPLC-MS/MS法同时测定白酒中8种甜味剂

2021-12-31张苗文红张啟恒董曼徐成黄亚平

食品工业 2021年12期

张苗，文红*，张啟恒，董曼，徐成，黄亚平

1. 湖北省食品质量安全监督检验研究院（武汉 430075）；2. 湖北省食品质量安全检测工程技术研究中心（武汉 430075）

白酒之所以具有醇甜之感，主要来源于粮食发酵过程中产生的醇类，特别是多元醇，因甜味来自醇基，当物质的羟基增加时，其醇的甜味也增加，多元醇都有甜味基团和助甜基团，如己六醇、丙三醇、丁四醇、戊五醇等[1-2]。品质优良的白酒由于其复杂特殊的酿造工艺，在发酵过程中就能产生一些醇甜物质，但这一切的实现都需要一定时间、精良的技术以及优良的原料。而很多技术工艺不达标、原材料品质不好的小酒厂为了让酒口感变好，可能会在制造过程中添加一些甜味剂和其他物质来赋予酒类良好的口感[3-7]。

甜味剂在GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中的定义是赋予食品甜味的物质，根据标准白酒中大部分甜味剂都是不得使用的，通过市场监管总局每年抽检监测公布的白酒不合格数据来看，因为超范围使用甜味剂的情况占整体不合格率的比重较大，说明在白酒的生产过程中还存在违规添加甜味剂的情况。因此，建立一种高准确度、高灵敏度、高效快速的甜味剂检测方法，加强白酒中甜味剂的监管就显得尤为重要。

目前国家抽检监测白酒中甜味剂的项目主要是甜菊糖苷、甜菊双糖苷、安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜和纽甜这8种。通过查询相应实施细则和国家标准方法发现，这8种甜味剂只有甜蜜素采用高效液相色谱-质谱联用法，其余的糖精钠、三氯蔗糖、纽甜这3种甜味剂均采用高效液相色谱法，而现有检测甜菊糖苷、甜菊双糖苷、安赛蜜、阿斯巴甜的国家标准方法不适用于白酒的检测。

目前国内有关检测甜味剂的方法主要有液相色谱法[8-9]、离子色谱法[10-11]、毛细管电泳法[12-13]、电化学法[14]等，主要以液相色谱法为主。由于不同甜味剂的分子结构式、化学性质和光谱性质存在差异，以上方法在测定这8种甜味剂混合物时存在一定的缺陷，一般只能用来分析其中一种或结构相似的几种甜味剂混合物。其中，液相色谱-串联质谱法[15]因其选择性强、灵敏度高和抗干扰能力强的优点在甜味剂的分析检测中被广泛应用。然而，已报道的质谱检测方法并未完全覆盖国家抽检监测的这8种甜味剂。

试验建立了高效液相色谱-质谱联用法同时检测白酒中8种甜味剂的方法，通过考察稀释倍数和增加加热净化的步骤，基本上排除了基质效应的影响，提升了该方法检测结果的稳定可靠性。方法简单快捷、准确可靠，既能确保检验结果的准确性，又能提高检验效率。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

TQD超高效液相色谱-串联质谱仪（美国Waters公司）；分析天平（瑞士梅特勒公司）；涡旋混匀器（德国IKA公司）；Milli2Q型超纯水器（美国Millipore公司）；恒温水浴锅（德国美墨尔特公司）。

乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；乙酸铵（色谱纯，美国Sigma公司）；甲酸（色谱纯，上海安谱科学仪器有限公司）。

对照品：甜菊糖苷（Stevioside，纯度99.7%，CAS号57817-89-7）、甜菊双糖苷（Steviolbioside，纯度98.7%，CAS号41093-60-1）、安赛蜜（Acesulfame Potassium，纯度99.0%，CAS号33665-90-6）、糖精钠（Sodium saccharine，纯度99.9%，CAS号128-44-9）、甜蜜素（Sodium N-cyclohexylsulfamate，纯度98.9%，CAS号139-05-9）、三氯蔗糖（Sucralose，纯度99.0%，CAS号56038-13-2）、阿斯巴甜（Aspartame，纯度97.2%，CAS号22839-47-0）、纽甜（Neotame，纯度99.4%，CAS号165450-17-9），均购于上海安谱科学仪器有限公司。

1.2 标准溶液的配制

分别称取10.0 mg甜菊糖苷、甜菊双糖苷、安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、纽甜标准品，用水溶解并定容至10.0 mL容量瓶中，配制成质量浓度均为1.0 mg/mL的单标储备液，置于4 ℃冰箱中保存。

用移液器分别准确移取1.0 mL单标储备液于100.0 mL容量瓶中，用水稀释并定容至刻度，配制成质量浓度为10.0 μg/mL的混合标准中间液；最后，移取不同体积的混合标准中间液，用空白基质配制成一系列不同浓度的混合标准工作液，临用前配制。

1.3 样品前处理

称取10.0 g（精确至0.01 g）酒样，置于50 mL烧杯中，在60 ℃水浴中边加热边用玻璃棒搅拌约10 min，残渣全部转移至100.0 mL容量瓶中，用10 mL超纯水洗烧杯并转移至容量瓶中，用水定容至刻度并摇匀，经0.22 μm水相微孔滤膜过滤后备用。如果样品溶液的甜味剂含量过高，可根据实际浓度适当稀释至标准曲线范围内。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱为Waters BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温为30 ℃；流动相：A为乙腈，B为0.1%甲酸水；流速为0.3 mL/min。梯度洗脱程序：0～0.5 min，10% A；0.5～2.5 min，10% A～90% A；2.5～3.0 min，90% A；3.1～3.5 min，90% A～10% A；3.6～5.0 min，10% A。进样量为5 μL。

1.4.2 质谱条件

离子源为电喷雾电离（ESI）源；根据被测化合物在正、负离子扫描模式下响应灵敏度的大小，选择正离子扫描方式或负离子扫描方式；检测模式为多反应监测（MRM）模式。质谱采用正、负离子同时扫描，去溶剂气流量为1 000 L/Hr；去溶剂气温度为450℃；毛细管电压为2.50 kV。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

试验分别考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水作为流动相体系时的分离效果，结果发现使用乙腈-0.1%甲酸水作为流动相时，所有目标化合物均能在5.0 min以内出峰，且大部分化合物响应比使用其他3种流动相时响应明显增强，化合物之间分离效果较好。因此，选择使用乙腈-0.1%甲酸水作为流动相体系，此时8种目标化合物分析时间较短，分离效果好且响应高。

2.2 质谱条件的优化

首先采用手动调谐中MS Scan（全扫描）的方式进行质谱全扫描检测，得出被测化合物的一级质谱图，找出每个化合物对应的母离子，通过调整毛细管电压、锥孔电压、去溶剂气温度、去溶剂气流量，找到目标母离子最强的信号，确定母离子的准确质量数。然后打开氩气采用子离子扫描，确定主要离子碎片后，通过优化各个子离子的碰撞能量，最后得到甜菊糖苷、甜菊双糖苷、安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、纽甜8种甜味剂的最优质谱参数，如表1所示。甜菊糖苷、甜菊双糖苷、安赛蜜、糖精钠、三氯蔗糖、阿斯巴甜、纽甜仅在负离子模式下有很好的响应，而甜蜜素在正负离子模式下均有明显的响应，故采用正负离子同时监测扫描。使用TQD超高效液相色谱-串联质谱仪对8种甜味剂进行分析，各待测化合物的多反应监测色谱图见图1。

图1 8种目标化合物的多反应监测色谱图

表1 8种目标化合物的质谱参数

2.3 方法学评价

2.3.1 基质效应

由于白酒是以曲类、酒母为糖化发酵剂，利用淀粉质原料，经蒸煮、糖化、发酵、蒸馏、陈酿和勾兑而酿制成的酒，基质中的杂质成分复杂，以电喷雾电离源为离子源的质谱分析可能会产生基质效应，影响分析结果的准确度和灵敏度。在没有稀释的白酒原液中加入一定量的混合标准溶液，配制成质量浓度为100 ng/mL的加标样品，以考察基质效应对目标化合物的影响。结果表明，白酒样品受基质干扰影响比较大，采用定容溶剂配制成的标准曲线处理加标样品，大部分的目标化合物回收率均低于80%。

为了消除白酒基质对目标化合物定量的影响，在前处理中加入待处理样品在60 ℃水浴中边加热边用玻璃棒搅拌约10 min这一步骤，目的是为了除去白酒样品中沸点较低的醛类和醇类，起到净化样品的作用。然后考察白酒稀释1，2，5，10和20倍后，白酒样品作为定容溶剂绘制标曲曲线。结果表明，稀释10倍和20倍的白酒样品作为定容溶剂配制的标准曲线相关系数R2均大于0.995，而稀释倍数在10倍以下的白酒样品作为定容溶剂配制的标准曲线相关系数R2均小于0.99。考虑到稀释倍数会影响方法的检出限和定量限，试验最终采用稀释10倍的白酒样品作为空白基质配制标准曲线进行方法学考察。

2.3.2 方法的线性范围、检出限和定量限

取1.2小节配制的混合标准工作液，以目标化合物的定量离子的峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标绘制标准曲线。结果表明，在考察的线性范围内，8种目标化合物均呈现良好的线性关系，相关系数均≥0.995。

通过向白酒的阴性样品中添加8种待测成分，考察方法的检出限（S/N≥3）和定量限（S/N≥10），不同目标物的检出限为15～30 μg/kg，定量限为50～100 μg/kg（见表2）。

表2 8种目标化合物的线性范围、检出限和定量限

2.3.3 回收率和精密度

按照1.3小节的前处理方法，向空白基质中准确加入一定量的混合标准溶液，配制成4个水平（50，100，200和500 μg/kg）的加标样品，进行加标回收率和精密度试验（n=6），结果见表3。空白基质中8种化合物的平均回收率为80.2%～97.4%，相对标准偏差为2.4%～9.7%。方法的加标回收率和精密度均符合GB/T 27404实验室质量控制规范的要求。

表3 白酒中8种目标化合物的加标回收率和相对标准差（n=6）

2.4 实际样品检测

采用试验方法对某酒厂送检的4种不同类型的原酒进行检测。结果表明：#1号样品检测出三氯蔗糖、纽甜、阿斯巴甜、糖精钠、安赛蜜、甜蜜素、甜菊糖苷这7种甜味剂，质量分数分别是131，1 978，3 174，924，135，128和140 μg/kg；#2号样品检测出纽甜、阿斯巴甜、糖精钠这3种甜味剂，质量分数分别是540，1 180和101 μg/kg；#3号样品检测出三氯蔗糖、纽甜、阿斯巴甜、糖精钠、安赛蜜、甜蜜素这6种甜味剂，质量分数分别是142，2 210，2 880，999，142和121 μg/kg；#4号样品检测出纽甜、阿斯巴甜、糖精钠这3种甜味剂，质量分数分别是403，1 300和58.2 μg/kg。