响应面法优化Chaetomium aureum所产色素的提取工艺

李亚，马建鹏，张静，梁晨，杨斌，赵宁,*

1. 西南林业大学生命科学学院（昆明 650224）；2. 大理白族自治州林业和草原有害生物防治检疫局（大理 675600）；3. 西南林业大学云南省森林灾害预警与控制重点实验室（昆明 650224）

色素在生活中的各个领域都有广泛应用[1-2]。随着人们对于安全性问题的关注度越来越高，天然色素的应用得到更广泛关注[3-4]。微生物色素[5-6]由于具有生产不受时空限制的优点，受到越来越多研究者的关注，并致力于开发新的可产色素微生物。其中，真菌由于其易培养、生长快的优点受到重视，已发现真菌色素有600余种[7]，如曲霉属、青霉属等[8-10]真菌都可产生色素。但大多数真菌色素性质不稳定，开发出稳定的真菌色素是研究的热点。C.aureum属于毛壳菌科毛壳菌属真菌[11]，在一定的培养条件下会有色素产生，常被当作生防菌应用[12-13]，对其所产的色素至今尚无相关报道。

响应面法（RSM）[14]是一种根据单因素试验结果设计试验组合，依据求出的多元二次方程来拟合多个因素及其交互作用与响应值之间的关系，以此优化最佳试验组合的方法。其简单、高效，能通过最少的试验次数优化得到最佳试验结果，是提取条件优化中最常使用的方法[15-16]。张素敏等[17]利用响应面法优化黑米色素的提取条件；何亚涛等[18]使用响应面法优化Monascus sanguineus所产红色素的提取条件，均得到理想的提取条件。

试验以C.aureum为原料，以响应面法优化C.aureum所产色素的最佳提取工艺，为C.aureum所产色素的应用和进一步研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源Chaetomium aureum（保存于西南林业大学生物化学教研室，菌株号YLHT-2A）。

1.1.2 培养基

PDA培养基。

1.1.3 仪器与试剂

无水乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚、葡萄糖（均为分析纯）。

SG5200HBT超声波清洗机（上海冠特超声仪器有限公司）；HWS12型恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）；TU-1901紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；YXQ-75SII立式压力蒸汽灭菌锅（上海博迅实业有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 色素最大吸收波长的确定

将实验室保藏的菌种YLHT-2A活化于PDA培养基上，待菌株培养至色素铺满培养基，将培养基划分成小块，以蒸馏水为溶剂，超声功率100 W、提取温度60 ℃、料液比1∶5（g/mL）、提取时间20 min、超声提取1次的条件下提取培养基中的色素，提取后过滤，将过滤得到的色素提取液在紫外可见分光光度计下380～780 nm的范围内进行全波长扫描，以5 nm为间隔，确定色素的最大吸收波长。

1.2.2 提取条件单因素试验

1.2.2.1 提取溶剂的筛选

以无水乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚、蒸馏水为提取溶剂，参照1.2.1中的方法提取出培养基中的色素，在最大吸收波长下检测色素提取液的吸光度，以吸光度为衡量指标[19]，考察不同提取溶剂对色素提取效率的影响。

1.2.2.2 提取条件的筛选

参照1.2.1中的方法，分别取不同超声功率（30，50，60，70，80和100 W）、提取温度（30，40，50，60，70和80 ℃）、提取时间（5，15，25，35，45和55 min）、料液比（1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5和1∶6 g/mL）和提取次数（1，2，3，4和5次）进行单因素试验，探究菌株所产色素的最佳提取条件。单因素试验时，除了改变所需探究的因素外，其余条件均保持超声功率100 W、提取温度60 ℃、料液比1∶5（g/mL）、提取时间20 min、超声提取1次。在最大吸收波长下检测色素提取液的吸光度，以吸光度为衡量指标，考察不同提取条件对色素提取效率的影响。

1.2.3 响应面优化提取条件

根据单因素试验结果，以提取温度、提取时间、提取次数、料液比为考察因素，根据Box-Behnken中心组合试验设计试验组合，每个因素设计3个水平，以代码值-1，0和1表示，因素水平表如表1所示。

表1 响应面设计因素及水平表

1.2.4 数据处理与分析

采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面分析，SPSS 22.0进行数据差异性分析，Origin Pro 9.1软件作图。

2 结果与分析

2.1 色素最大吸收波长确定

将提取得到的色素液在380～780 nm的范围内进行全波长扫描，结果表明，C.aureum所产色素的最大吸收波长在510 nm处（图1）。

图1 C. aureum所产色素光谱扫描曲线

2.2 单因素试验结果

2.2.1 提取溶剂筛选

选用无水乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚、蒸馏水5种不同溶剂浸提培养基中的色素，结果显示，C.aureum所产色素在蒸馏水为溶剂的条件下，吸光度最大，说明该色素水溶性较好，具有极大的极性，且不同提取溶剂间存在显著差异（p＜0.05）。C.aureum所产色素水溶性较好，选择蒸馏水为最佳提取溶剂（图2）。

图2 不同溶剂对C. aureum所产色素提取效果的影响

2.2.2 超声功率筛选

不同的超声功率对色素的提取效率影响结果如图3所示，超声功率30 W和100 W间存在显著差异（p＜0.05），超声功率100 W条件下，色素提取液吸光度最大，所以确定100 W为最佳超声功率。

图3 超声功率对C. aureum所产色素提取效果的影响

2.2.3 提取温度筛选

由图4可知，在超声提取色素的过程中，随着温度升高，提取液吸光度呈现先增加后降低趋势，温度达到50 ℃时，提取液A510nm为0.64，之后随着温度升高，温度为60 ℃时提取液吸光度达到最大，但二者之间提取液的吸光度无显著差异（p＞0.05），根据差异性分析原则选择50 ℃为后续试验的中心点。

图4 温度对C. aureum所产色素提取效果的影响

2.2.4 提取时间筛选

从图5可以看出，随着提取时间延长，色素提取液吸光度先升高后降低。提取时间25 min时提取液吸光度达到0.88，提取时间为35 min时吸光度达到最大，但在提取25 min之后增加提取时间，其提取液A510nm无显著差异（p＞0.05），因此根据差异性分析原则确定25 min为后续试验的中心点。

图5 时间对C. aureum所产色素提取效果的影响

2.2.5 提取料液比筛选

由图6可知，随着液体比例增大，色素A510nm逐渐增加，料液比1∶4（g/mL）时，其吸光度为0.56，料液比1∶5（g/mL）时，其吸光度达到最大，但二者之间无显著差异（p＞0.05），根据差异性分析原则，确定料液比1∶4（g/mL）为后续试验的中心点。

图6 料液比对C. aureum所产色素提取效果的影响

2.2.6 提取次数筛选

由图7可知，随着提取次数增加，提取液的A510nm逐渐增大，提取次数3次时，提取液吸光度达到1.10，之后增加提取次数，提取次数4次时，提取液吸光度达到最大，但所得提取液吸光度无显著差异（p＞0.05），可能是由于所提取的色素已达到饱和，根据差异性分析原则，确定提取3次为后续试验的中心点。

图7 提取次数对C. aureum所产色素提取效果的影响

2.3 响应面优化结果及分析

2.3.1 响应面优化试验设计及方差分析

在单因素试验设计的基础上，以提取时间A、提取温度B、料液比C、提取次数D为考察因素，以提取液吸光度为响应值，依据Design-Expert 8.0.6软件中的Box-Behnken试验设计原理设计试验组合，结果见表2。

根据表2中的试验组合设计试验，利用Design-Expert 8.0.6软件对表2结果进行分析，经回归拟合得到以吸光度为响应值的回归方程：Y吸光度=0.76-1.139E-003A-1.806E-003B+0.056C+0.017D+2.083E-003AB-9.833E-003AC+1.056E-003AD+6.917E-003BC+3.056E-004BD-2.722E-004CD+0.019A2-0.018B2-0.019C2+6.413E-003D2。

表2 响应面试验设计方案及结果

从表3可看出：模型显著性p＜0.000 1，失拟项p=0.969 2，大于0.05，说明该模型可靠性较好，用该回归方程解释各个因素与响应值之间的关系时具有较高的可信度；该回归方程模型的相关系数R2=0.925 4，说明有92.54%的数据都可用该方程进行解释，具有较高的相关性；校正决定系数Radj2=0.850 7，说明该模型能解释85.07%的响应值的变化，具有较高的可信度；变异系数C.V.=2.24%，该值可反映模型的置信度，即值越低，表明试验的可靠性越高，试验C.V.%值较低，说明该C.aureum所产色素提取优化方法的结果准确可靠。

表3 回归模型方差分析

2.3.2 响应面分析及最佳工艺探究

提取时间、提取温度、提取次数和料液比的交互作用对C.aureum所产色素的提取效率的影响如图8所示，等高线图能够更直观反映各个因素与响应值之间的关系，等高线越接近椭圆，表明因素间交互作用越显著[20]，结合方差分析结果可以看出各因素间的交互作用对色素的提取无显著影响。

图8 提取时间、提取温度、提取次数和料液比之间交互作用对C. aureum所产色素提取效果的影响

根据响应面优化结果可得出超声提取色素的最佳工艺条件为：提取时间70 min、提取温度52.94 ℃、料液比1∶4.33（g/mL）、提取5次。模型预测的结果吸光度为1.213 0。根据实验室实际条件将最佳提取条件更改为提取时间70 min、提取温度53 ℃、料液比1∶4.5（g/mL）、提取5次。做3次平行试验取平均值，结果得吸光度为1.225 7。模型预测值与实际测定值相对误差为1.05%，说明最终优化得到的模型方程真实有效。

3 结论与讨论

通过单因素试验筛选出提取时间、提取温度、料液比、提取次数等对色素提取效率影响较大的几个因素，在单因素试验基础上，通过响应面法设计4因素3水平试验优化C.aureum所产色素的提取工艺，得出水为最佳提取溶剂，最佳提取条件为：提取时间70 min、提取温度53 ℃、料液比1∶4.5（g/mL）、次数5次。得到的吸光度为1.225 7，与模型预测值1.213 0之间相对误差为1.05%，说明最终优化得到的C.aureum所产色素的提取方法真实可靠，具有一定可行性。

真菌色素的开发利用是色素市场的一大趋势，寻找到更多产色素的真菌可以丰富天然色素的来源。发掘新的真菌色素并使其工业化，是真菌色素资源开发中的重要步骤，试验对C.aureum所产色素的提取工艺进行优化探究，优化得到的提取工艺操作简单，所需试验仪器易操作，重复性好，具有一定可行性，且C.aureum易于培养，有着极大的应用价值和发展前景。